小鼠胸腺上皮细胞的分离、鉴定与纯化

本实验的总体目标是分离、鉴定并纯化胸腺上皮细胞（thymic epithelial cells，TEC）。首先通过酶消化和机械法破坏胸腺组织，将TEC解离为单细胞悬液；随后可通过流式细胞术对TEC进行分析，或采用平皿富集策略进行富集。

最终，可以通过荧光激活细胞分选法纯化胸腺上皮细胞亚群。该方法有助于回答T细胞发育领域的许多关键问题，例如：胸腺上皮细胞如何促进胸腺选择？衰老动物中胸腺功能障碍的原因是什么？以及我们如何在体外实现T细胞重建？

该技术的主要优势在于能够高效回收具有可变性的 Emmic 生殖细胞，无偏倚地富集 Emmic 上皮细胞，并通过细胞分选最终实现高纯度。为分离胸腺基质细胞，首先需确定胸腺位置，胸腺位于肋骨下方，外观呈覆盖于心脏表面的两个薄片状白色叶状结构。随后分离包裹胸腺的结缔组织，使用带齿弯镊轻轻牵拉并取出胸腺叶。

将叶瓣放入含有5毫升培养基的六孔板中，去除周围的脂肪和结缔组织。然后将修整后的叶瓣转移至新的孔中，加入5毫升 freshly prepared 酶溶液，并用精细剪刀在组织上做少量切口。将板置于37°C培养箱中。

孵育20分钟后，用5毫升移液管轻轻吹打组织数次，将匀浆解离成单细胞悬液。将上清液收集至含有10毫升冰上预冷的富含白蛋白缓冲液的50毫升离心管中，以中和酶活性。随后，向剩余组织中加入2.5毫升酶溶液。

将培养板孵育15分钟。随后，使用配备18基因针头的三毫升注射器轻轻搅动组织，以打碎任何聚集体。然后将组织转移至收集管中。

然后向剩余组织中加入 2.5 毫升酶溶液。将培养板孵育 15 分钟。第三次孵育后，使用 20 号 5G 针头重复进行机械振荡。

将组织孵育最后5到10分钟后，转移上清液至收集管中进行离心，通过流式细胞术鉴定回收的T细胞。按照标准抗体染色程序，将样品上机至多参数流式细胞仪，并使用相应的流式分析软件分析数据，进一步通过平皿富集法富集T细胞。首先，用适当的抗体孵育细胞以实现富集。接着，将细胞悬液加入预编码的平皿富集板中，轻轻摇晃平板并在室温下孵育。

30分钟后，剧烈振荡培养板，然后将上清液转移至锥形管中。用新鲜培养基将培养板清洗两次，每次的洗涤液均收集至收集管中。随后离心沉淀细胞，将沉淀重悬于5 mL新鲜培养基中，并将细胞悬液转移至新的平皿培养板中，通过振荡和孵育收集细胞，如前所述进一步纯化富集的胸腺细胞亚群。

使用适当的抗体标记后，通过100微米喷嘴进行荧光激活细胞分选（FACS），将细胞收集至含30%体积比FBS的培养基中。在此用于通过流式细胞术鉴定tech细胞的代表性设门策略中，可观察到tech细胞表达epca，但不表达CD45。因此，可根据ep、camm和CD45的表达情况对tech细胞设门。tech细胞包含皮质型（cortical，简称CEC）和髓质型（medullary，简称mTEC）胸腺上皮细胞亚群。

这些亚群可以通过活体51抗体进行区分，该抗体识别由cTEC表达的谷氨酰氨基肽酶，以及凝集素UEA-1，后者结合mTEC；cTEC和mTEC均在其表面表达MHC II类分子。尽管mTEC可根据其MHC II类分子表达水平进一步分为mTEC低表达和mTEC高表达两个群体，但使用上述刚演示的基于解离酶的方案，所获得的TEC数量约为使用胶原酶和透明质酸酶方案的8倍，从单只小鼠胸腺中可获得约9×10⁵个细胞。该方法有助于缩短分选时间，并提高所获得基质细胞的存活率。如上所述，可通过贴壁法（panning）去除胸腺细胞，从而获得相较于完整制备的胸腺细胞更为富集的基质细胞群体。

在富集后的细胞群体中，精原干细胞的比例从不足0.5%上升至超过15%。经过淘选后，精原干细胞各亚群的比例未发生改变，表明在淘选过程中任一亚群均未被选择性丢失。与富集前样品相比，精原干细胞的回收率约为85%。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过淘选法从小于一定数量的细胞中富集精原干细胞，以及如何通过流式细胞术鉴定并纯化精原上皮亚群。