使用差示扫描荧光法测定蛋白质-配体相互作用

本实验的总体目标是估算蛋白质与配体相互作用的解离常数。首先，将蛋白质与不同浓度的配体以及一种指示染料混合配制成系列样品；第二步，在加热这些样品的同时记录指示剂的荧光信号，以监测蛋白质的解折叠过程。

接下来，将蛋白质去折叠曲线转换为一系列熔解温度。最后一步是将这些数据拟合到适当的模型中，以估算解离常数。最终，差示扫描荧光法可用于更深入地理解蛋白质与其配体之间的相互作用。

与等温滴定、量热法和表面等离子体共振等现有方法相比，该技术的主要优势在于，仅需使用适量样品，并利用大多数科研机构已配备的仪器，即可在数小时内完成实验。该方法有助于解答蛋白质化学领域的关键问题，例如配体与蛋白质的亲和力以及相互作用的相对强度。通常，初学者在应用该方法时会面临困难，因为样品的选择和数据分析均具有较高难度。

开始此实验步骤之前，需配制以下溶液。配制包含本表中所列试剂的混合液，以及配体储备液（浓度为可获得的最高浓度），并配制该浓度的六次十倍稀释液。若根据先前数据已知近似的解离常数（kd），则应至少配制两个高于和低于 kd 的浓度。

此处展示一个示例表格。将混合物各18 µL分装至八个孔中。在A-Q-P-C-R板中，向第一孔加入2 µL溶剂，向其余七个孔分别加入2 µL配体稀释系列的各组分。

将 A-Q-P-C-R 密封膜覆盖在板上，以确保板的密封性。将手动压膜器置于板的中央，向一侧轻轻压平密封膜，然后在板的另一半重复此操作。以 500 ×g 离心两分钟，以去除气泡。

接下来，将反应板放入一步法QPCR仪中。选择熔解曲线选项中的rocks滤光片，并选择快速升降温速率。在仪器运行结束后，进行热变性分析。

单击屏幕上的分析按钮。保存结果文件。打开蛋白质热转移软件。

在属性选项卡中创建一项新研究。为其命名，然后在条件选项卡中详细填写配体信息。切换到实验文件选项卡，并导入已保存的结果文件。

设置每一项的内容。接下来转到分析选项卡，按下分析按钮以分析结果。检查仅存在溶剂时的蛋白质是否给出与本图所示相似的结果。

接下来，观察重复实验中测得的熔解温度结果，确保随着配体浓度的增加，熔解温度呈现明显上升趋势。这些数据将用于估算解离常数，具体方法详见配套论文。

这些溶液是测定解离常数所需的，包括根据本表配制的预混液，以及配制为15种不同浓度的配体储备液，这些储备液将进行十倍稀释。在最终实验中，理想情况下应包含至少比估计的kd值高两个数量级和低两个数量级的配体浓度，并以估计的kd值为中心设置浓度梯度。

此处展示了一个稀释系列的示例。请关注估计 KD 值附近一个数量级范围内的七个数据点，并在此范围两侧各增加四个数据点。如果有选择余地，应包含更多处于饱和浓度下的数据点。

在96孔U型底培养板的八个孔中，每孔加入120微升主混合液，作为主混合液的储备液以便于分装。然后使用八通道移液器将18微升主混合液加入PCR板的一列中。重复此步骤，再向另外五列加样，最终在PCR板上形成6行×8列共48个加样孔的分布模式。

接下来，向8个孔中的每一个孔加入20微升配体储备液或溶剂。在另一个U型底96孔板中，使用八通道移液器吸取8种不同配体储备液或溶剂各2微升，并将其加入已加入预混液的PCR板的一列孔中。使用相同的8种配体或溶剂储备液重复该步骤。

对于另外两列，从剩余的八种配体或溶剂储备液中各吸取两微升，并将其加入到板中的第四列。对另外两列重复此操作。这样可为全部16种配体和溶剂样品提供三份重复样本。

将 A-Q-P-C-R 密封膜盖在板上。以 500 ×g 离心板 2 分钟。将板放入 QPCR 仪器中，并在仪器运行结束时，使用先前指定的参数进行热变性程序。

点击屏幕上的分析按钮。保存结果文件。打开蛋白质热转移软件。

在属性选项卡中创建一项新研究。为其命名，并在条件选项卡中详细填写配体信息。切换到实验文件选项卡，导入已保存的结果文件并设置每一项内容。

切换到分析选项卡并点击分析按钮。从屏幕左侧的菜单中选择“重复样本”选项卡以查看结果，以三复孔形式进行。

根据三个重复样本的接近程度评估数据的可靠性。若重复样本显示较差的可重复性，则应仔细检查原始数据。

使用Boltzmann方法或导数方法分析数据。为评估熔解温度，在重复实验结果选项卡中，于重复实验结果图内通过按钮在Tm、Boltzmann和Tm导数之间切换曲线图。为样本选择重现性更优的方法。

对于显示多个转变的样品，几乎总是最好在多重熔解模式下使用微分法。使用导出选项卡将结果导出，以便在 Excel 中进一步分析。首先在 Excel 中创建一个表格，列出配体浓度和熔解温度。

打开 GraphPad Prism 软件并创建一个 XY 表格。使用 X 列输入配体浓度数据，使用 Y 列输入熔解温度结果。在分析选项卡中，选择非线性回归曲线拟合选项。

要输入正确的模型，请选择“新建”并创建新方程。插入适当的方程作为单一位点配体结合方程。选中初始值规则框，并输入初始值的规则。

将参数 P 限制为常数，等于蛋白的最终浓度。选择“分析”以执行分析，选择“附加分析”以将数据拟合到协同模型或曲线拟合。二元熔解温度变化的说明见配套的实验方案文本。

该方法用于测定己糖激酶与葡萄糖的相互作用。初步筛选表明，其解离常数（KD）可能在 0.2 至 1.7 毫摩尔之间。更大规模筛选的结果显示，数据与单一位点结合模型拟合良好，解离常数 KD 为 1.2 ± 0.1 毫摩尔。假定的 HETO SQUA L 转移酶 WCBM 在结合 GTP 时表现出显著的热漂移。

初步筛选表明其解离常数（KD）为 200 至 500 微摩尔。详细实验显示表观 KD 为 120 ± 20 微摩尔。然而，当 X 轴采用对数刻度时，模型与数据分析之间存在显著差异；而使用协同结合模型分析相同数据则显示出极佳的拟合效果，提示 WCBM 与 GTPA 结合时呈现负协同效应。在考察假定的 GDP 60、氧代-β-D-甘露糖、Heur two oh、ACE WCBI 时，观察到相当不寻常的结果。

在无配体以及高配体浓度下，观察到简单的单相熔解曲线。然而，在中等配体浓度下，则观察到两个 distinct 的熔解峰。这两组峰之间的转变在模拟双相熔解的整个浓度范围内均呈现剂量依赖性。

作为配体比例、游离态及高配体浓度下结果的总和，该数据拟合良好。通过将高配体浓度下的观测结果外推至完全占据状态，可进一步改善拟合效果。所获得的WCBI与配体结合比例数据与简单的结合模型表现出极佳的拟合度。

其解离常数（KD）为 58 ± 2 微摩尔。一旦掌握，若操作得当，包括重复实验在内，该技术可在四到五小时内完成。在本实验流程基础上，还可采用其他方法，如尖端静脉荧光法和等温滴定热量法，以回答更多问题，例如温度依赖性和 STA 几何构型。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用差示扫描荧光法估算分子相互作用的解离常数。