生物层干涉技术用于测定蛋白质-蛋白质相互作用动力学及变构配体效应

以下实验的总体目标是利用生物层干涉技术（BLI）来测量蛋白质的动力学、蛋白质相互作用以及小分子配体对这些相互作用的变构效应。该目标通过将其中一种蛋白质特异性地生物素化，并将其平行固定在链霉亲和素包被的生物传感器表面来实现。

第二步，将与传感器结合的蛋白质暴露于含有其结合伴侣的缓冲液中，并通过检测传感器表面光干涉信号的实时变化来监测结合过程。随后，将每个传感器转移至不含结合伴侣的缓冲液中，以实时测量蛋白质的解离过程。蛋白质复合物。

所获得的结果可用于确定相互作用蛋白质结合与解离的动力学速率常数，从而推算其结合亲和力。进一步的结果表明，生物膜层干涉技术（BLI）能够检测小分子配体对蛋白质-蛋白质复合物解离速率的影响。与表面等离子共振等现有方法相比，该技术的主要优势在于对折射率变化不甚敏感。

因此，结合与关联步骤可引入小分子配体的变化，以实时检测其对蛋白质-蛋白质相互作用的影响。尽管如此，该方法仍可提供关于蛋白质-蛋白质相互作用动力学的信息。该方法也可应用于其他组合，例如蛋白质与固定化DNA或RNA的结合，或脂质体与固定化蛋白质的结合。开始本实验时，需按照文本方案中所述设置BLI仪器。

然后在数据采集软件中设置实验设计。在实验向导选项卡中选择新建动力学实验。这将显示一个分步菜单，所有必须定义的步骤均位于第一个选项卡中。

定义要使用的列。在96孔样品板上，指定各列用于盛装缓冲液、待固定化的蛋白质或结合伴侣。

对于每个结合反应，需输入所用结合伴侣的浓度。在第二个选项卡中，定义实验所需的全部步骤，包括基线加载、结合伴侣的结合和解离阶段。

通过选择检测步骤，然后双击样品板上相应的列，可将各个检测步骤与板上的列孔关联起来。此操作可编程传感器从一个孔列移动到下一个孔列。在检测过程中，首先使用与第一列孔连接的缓冲液进行短暂的基线步骤，以在96孔板中建立初始BLI信号。

然后将上样步骤连接至含有生物素化蛋白的孔。使用阈值功能以达到预定的结合水平。设置阈值选项，使所有传感器均移至下一列孔中。

当任意一个传感器达到阈值时，在缓冲液中加入另一个基线步骤，以洗去传感器上未固定的生物素化蛋白质，并建立新的稳定基线信号；对于基础检测，为确定全局结合与解离速率常数，需在结合步骤之前，将传感器置于新的一列缓冲液孔中进行额外的基线步骤。接下来，连接结合步骤，将传感器转移至含有不同浓度结合配体的孔板列中。

调整步长时间，以确保结合配体至少达到饱和浓度并实现平衡结合信号。对于解离步骤，设定传感器返回至第四列，即在结合前用于额外基线测定的相同缓冲液孔。如果结合和解离速率比预期更快或更慢，可在实验过程中调整结合和解离步骤的时间。

在第三个选项卡中，标明传感器托盘中将放置预润湿传感器的位点。第四个选项卡可对程序进行图形化审查。在第五个选项卡中，输入必要的详细信息，包括数据文件的存储位置和所需的温度。

进行实验时，需预先将链霉亲和素包被的传感器润湿至少10分钟，以去除其保护性的蔗糖包被。将装有传感器的架子从传感器托盘中取出，并在托盘底部插入一块96孔板，将板的一个角滑入托盘上的定位凹槽中。

对于要使用的传感器列，每孔加入 200 微升检测缓冲液。将 96 孔板中该列传感器架按编程时指定的正确方向放回托盘中，同时在样品板的孔中加入检测缓冲液或相应的蛋白质稀释液。避免产生气泡，因为气泡可能导致光信号噪声。

设置一个或多个对照孔，分别省略生物素化蛋白或结合伴侣。打开仪器门，观察传感器臂的光输出。将传感器托盘的标签插入载物台的槽口中，然后将托盘放置在载物台上。

将样本板插入板架中，确保板子平整放置，并按照板架上所示的方向正确对齐。关闭门，然后从数据采集程序中启动检测。

如果传感器仍需要预先润湿，请选择延迟开始实验的选项。最后，当所有样品制备完成后，并且样品板和传感器托盘均已装入仪器，点击“开始”按钮以运行检测。检测完成后，打开数据分析软件，加载包含数据的文件夹。

单击处理选项卡，查看分步处理菜单以及原始动力学数据，数据选择下每个传感器以不同颜色表示。在样品板图上单击传感器选择按钮。在处理菜单中将一个或两个对照传感器的孔指定为参考孔。

勾选减法框，并选择参考孔，以从其他所有传感器信号中减去参考信号。使用“Y轴对齐”步骤将所有曲线对齐至Y等于零。然后选择基线作为时间范围的对齐步骤。

输入该基线的最后10秒。点击基线步骤内的区域将显示对齐情况。接下来，勾选“步间校正”复选框，以最小化结合步骤与解离步骤之间的信号漂移。

选择一条用于基线或解离的曲线。大多数情况下选择KY过滤功能，然后点击“处理数据”以在右下面板中目视检查最终处理后的数据。要分析数据，请点击数据分析中的“分析”标签页，选择分析步骤，然后选择结合与解离。

在模型中，选择“一对一”进行拟合，并选择“全局”（global）。在“分组依据”（group by）中选择“颜色”（color），并选择“Rmax不链接至传感器”（r max unlinked by sensor），以允许在配体与固定化蛋白达到饱和结合时，对最大信号响应进行独立拟合。最后，点击“拟合曲线”（fit curves）以开始非线性回归分析。

检查拟合结果，其中包括回归曲线与传感器数据轨迹的叠加图、拟合残差图以及包含确定的参数值和统计信息的表格。此处显示的是实时结合与解离的BLI动力学结果。本实验首先进行了10分钟的基线步骤，因为传感器仅经过短暂预湿，随后将生物素化的epsilon加载到传感器上。

在整个后续所有步骤中，如参考曲线所示（该曲线未添加结合伴侣），均未检测到ε的解离。第二个参考传感器未固定可移动蛋白，显示结合伴侣的非特异性结合水平较低。在A至F传感器的结合步骤中，使用了不同浓度的F1减去ε，以便对结果进行全局拟合，获得最佳的结合速率常数及平衡解离常数KD；结果经处理后得到蓝色数据轨迹。

在此情况下，通过从样品信号中减去参照传感器信号，以校正结合伙伴的非特异性结合以及系统信号漂移。在数据分析步骤中，所有曲线均采用一对一模型进行全局拟合。该全局拟合假设结合伙伴完全解离。

此处展示了另一个实验，其中酶结合了固定在传感器上的ε亚基，并存在于一毫摩尔浓度的A-T-P-A-D-T-A条件下。这使得大多数F1-ε复合物倾向于形成非抑制性构象，该构象可轻易解离。随后将传感器转移至含有不同配体的解离缓冲液孔中。该实验演示了不同配体对ε亚基构象的影响。

例如，暴露于镁离子、GTP 和磷酸盐会显著减缓净解离速率，表明 ε 亚基转变为紧密结合的抑制状态。首次建立 BLI 检测时，重要的是要包含对照实验，以检测蛋白质与传感器之间是否存在非特异性结合，并评估非特异性结合是否随拟使用的蛋白质浓度发生显著变化。观看本视频后，您应能够充分理解如何设计、运行和分析 BLI 检测，以测量蛋白质-蛋白质相互作用的动力学，并深入认识这一点。

BLI 可用于直接检测小分子配体对蛋白质-蛋白质相互作用的影响。