平底式气浮平台：一种将清醒自由活动啮齿类动物行为学与显微成像或电生理记录相结合的新方法

您好，我是赫尔辛基大学近科学中心的研究生Hel Lin。今天，我和我的同事们将向您展示如何在清醒、头部固定但身体可自由活动并能进行行为学表现的动物中进行光学和电生理记录。我们的方法为小鼠创建了一个真实且熟悉的环境，使其能够在此环境中自由导航和探索。

在需要牢固固定动物头部的显微成像或单细胞电生理记录过程中，我们植入慢性颅窗，并使小鼠适应一种悬浮的移动式饲养笼，该饲养笼可在动物足下自由滑动。当小鼠在平坦表面运动时，可将移动式饲养笼置于标准直立式显微镜下进行双光子成像，或放入电生理装置中，用于清醒小鼠脑组织的膜片钳记录。本文所述所有实验操作均已经过当地伦理委员会批准。

我们根据已发表的方案对颅窗植入步骤进行了轻微修改后进行手术。动物术后需恢复至少两到三周，在此恢复期间，颅窗通常会恢复透明。任何存在术后炎症残留迹象的动物均被排除在实验之外。

在研究中选择动物进行训练，使其适应头部固定。在可移动的饲养笼中，以平稳的方式抓取小鼠，持续5到10分钟，避免突然的动作和噪音，然后将其放回饲养笼中。以不等的时间间隔重复该操作两到三次。

移动式家庭笼具可在不对动物进行麻醉的情况下实现头部固定。使用布巾以不等间距将小鼠缠绕两到三圈。确保动物在包裹过程中保持安静。

否则，重复该操作直至小鼠完全适应。在完成抓取操作后的第二天开始，每天进行两次小鼠在移动式家笼上的训练。每次训练前称量动物体重。

体重减轻超过10%的动物应从研究中剔除。调整头部固定臂的位置，以适应训练动物的体型。将移动式家笼装置的进气口连接至标准实验室压缩空气出口。

确保气压足以使气动升降的家鼠笼自由漂浮。在可移动的家鼠笼中开始对已适应的动物进行训练。用布包裹小鼠以使其固定不动。

将固定在动物头部的金属支架插入头部固定臂中，并通过拧紧螺丝牢固固定。打开气流，使气浮式鼠笼悬浮。移除布片，让小鼠探索其鼠笼环境。

在第一次训练过程中，小鼠可能会出现僵直、颤抖以及尾巴竖起的行为。为了使动物适应噪音环境，可在所有训练阶段及实验过程中，使用收音机广播、录制的音乐或语音等方式持续提供环境声音刺激。为避免产生慢性应激反应，训练开始的第一个小时内应使用明亮光照。

第一个小时后，在黑暗环境中进行训练，并使用近红外相机监测动物的行为。训练结束后，通过松开螺钉将动物从头部固定装置上释放。在下一次训练之前，将动物放回其饲养笼中至少两小时。

将小鼠与另外两只或更多小鼠共同饲养在一个笼子中，可降低其应激水平。此外，您可以将转移过来的笼子与动物一同放置在其原有笼子中。这将丰富其生活环境，并可能增强动物对移动笼子的适应性。

在最后一次训练过程中，小鼠应适应头部固定，并在悬浮的家笼周围平静地活动，表现出无应激行为。在无可见光条件下，可通过近红外相机或光学鼠标监测笼子的运动，从而追踪小鼠的运动轨迹。在持续时间超过一至两小时的长时间训练过程中，可考虑通过手动方式或使用固定在移动家笼框架上的移液器支架为小鼠提供饮用水。

下图总结了一项典型实验研究的时间线。研究开始于小鼠操作前两周植入颅窗，随后进行八次每日两次的训练。典型的研究包括多次成像或膜片钳记录会话，各会话之间间隔数小时至数天或数周不等。

光学和电生理实验均可与认知或行为刺激及读出信号并行进行。双光子显微镜是一种独特的非线性光学技术，可实现实时观察啮齿类动物大脑皮层深层中的细胞甚至亚细胞结构。进行双光子显微成像实验时，将训练好的动物放入可移动的居家笼中，并调整限位器，以保护显微镜光学元件免受意外损坏。

清洁颅窗盖玻片以去除灰尘颗粒。在盖玻片上滴加浸没液。我们推荐使用黏性溶液，因为水会迅速蒸发。

该平台可放置在典型的电动光学平台上，使用荧光显微镜的宽场模式和长通发射滤光片。评估脑血管系统并选择感兴趣的区域。为成像皮层血管系统，需向头部固定且身体固定的动物尾静脉注射一种70千道尔顿的Texas red标记的葡聚糖。

该图像序列显示了一只在移动式家庭笼内活动的小鼠大脑皮层中血管和小动脉的时间推移记录。通过绘制穿过血管管腔的线段轮廓，可以测量血管直径的变化以及单个血管节段的运动性。通过沿平行于血管壁绘制的线进行线扫描，可测量动脉和静脉中的血流速度。良好。

在表达YFP的转基因小鼠中，可以观察到神经元形态的细节，其中YFP在台湾启动子驱动下于特定神经元亚群中表达。这两幅Zacks图像比较了麻醉状态与清醒状态下动物成像的稳定性。右侧图显示的是使用氯胺酮-赛拉嗪混合物麻醉动物后所获得的树突结构。

左侧面板显示的是清醒动物在移动的活动笼内行走时的树突图像。在清醒动物中，单个树突棘形态的分析可以达到与麻醉小鼠相同水平的可靠性和精确度。动物奔跑时脑组织的位移通常不超过一到一点五微米。

这些运动发生在水平方向，极少导致成像平面的偏移，因此无需校正运动伪影。在大多数情况下，能够长期监测清醒活体脑中的神经元活动，对于理解神经系统的结构与功能至关重要。利用Tie1-GCaMP3转基因小鼠，我们在小鼠于移动式家居笼中自由活动时，对其清醒状态下的自发性神经元活动进行成像。

此延时图像序列展示了神经元胞体、树突和轴突中钙峰的代表性实例。基于内源信号的光学成像可用于绘制功能域的空间分布图，以进行内源性光学成像实验。将经过训练的动物置于位于物镜下方的饲养笼中。

清除盖玻片上的灰尘。滴加一滴甘油，并用直径五毫米的圆形盖玻片覆盖。调节高速相机的位置。

将带有吹气管的操纵器置于对侧振动器的对面。使用绿光成像血管图谱。将焦点深入皮层，大约位于皮层血管下方400 µm处。

将带通滤光片置于相机前方，并用红光照射皮层。让小鼠在平台上适应至少30分钟。记录六分钟时段内的基线活动。

每10秒使用气流脉冲刺激振动器，持续六分钟。该图像展示了在0.05赫兹振动刺激下，神经活动在体感皮层中的传播。为进行单细胞电生理记录，将已植入倒置颅窗的训练动物置于可移动的居家笼中。

缓慢而小心地从金属支架上取下盖玻片。更换皮层缓冲液，并用止血棉签清除颅窗上的碎屑。将接地电极放入皮层缓冲液中。

用细胞内液填充膜片钳电极。使用电动显微操作器向记录电极施加正压，将电极深入皮层，并与目标细胞形成吉欧封接。记录完成后，取出电极，更换皮层灌流液，并将盖玻片用胶水粘合至金属固定架以封闭颅窗。

使用气动升降的家养笼可将成像和电生理学技术与经典的行为学范式（如学习、康复或与焦虑相关的行为）相结合。嗅觉对小鼠而言是一种重要的感觉输入，可用于记忆测试中的刺激以及对新奇事物反应的评估。进行习惯化-去习惯化嗅觉测试时，将训练好的动物放入可移动的家养笼中，使其适应环境。

用双面胶带将一块浸有自来水的干净棉球固定在活动居所笼子的内壁上，持续30分钟。五分钟后，将笼壁上干净的棉球更换为一块浸有香草气味液体的新棉球。每次暴露于香草气味持续五分钟，重复三次，每次之间间隔五分钟。

为了测量动物对气味的兴趣程度，记录动物面向目标区域的累积时间以及移动家笼的总时间。在最后一次（第五次）实验阶段，呈现一种具有社会意义的气味。

用异性小鼠的几滴尿液润湿新的棉签。为评估对新奇性的反应，将活动的家养笼箱分为四个区域。将两块棉片相对放置。颜色。

在首次试验期间，使用标记物在饲养笼外侧墙壁上进行标记。放置两块干净的棉片，然后将这两块棉片均替换为浸有1%香草提取物的棉片。

在第三次试验中，将香草味棉球置于1号区域，将浸有1%香蕉提取物的棉球置于2号区域，以测量动物对无气味区域的偏好。计算动物面向无气味区域的时间占其面向其他区域总时间的百分比。

大家好，我是赫尔辛基大学神经科学中心的首席研究员 Leo Kiro。希望您观看了视频后感到有所收获并觉得有用。在过去五年中，我们一直在使用双光子显微镜进行活体成像研究，而全身麻醉剂的使用始终是一个重要问题，因为麻醉剂会影响大脑功能、血流以及其他生理过程。

今天，我很高兴我们能够在清醒的动物中开展工作，进行稳定的显微成像实验，并验证此前在麻醉动物中获得的结果。我相信，移动式家居笼的使用以及我们今天所展示的方法将普遍提升活体研究的相关性，并带来新的、突破性的研究成果，我对此充满期待。