同步进行啮齿类动物大脑皮层的脑电图记录、乳酸浓度实时测量与光遗传学神经元活动操控

本实验的总体目标是在精确的立体定位坐标处进行光遗传学刺激的同时，测量脑电图定义的睡眠状态和乳酸浓度。手术植入必要的脑电图电极以及用于乳酸传感器和光纤的套管，然后将光纤和预先校准的乳酸传感器插入动物颅骨中的引导套管内。

接下来，调整蓝光刺激强度以获得所需的电生理反应。然后在动物自由活动或睡眠时，采集脑电图、肌电图和乳酸浓度数据。与其他方法（如脑电图的药理学研究）相比，该实验方法的优势在于能够在亚秒级时间尺度上实时操控神经元活动的同时，监测大脑的生物化学和电生理活动。

因此，该研究在睡眠领域产生新见解的潜力很高。例如，可以识别慢波睡眠的代谢和电生理伴随现象。此类实验还可应用于神经科学的其他领域，如学习与记忆、突触可塑性或癫痫类疾病。

该手术技术在操作上具有较高难度，需要具备良好的灵巧性，而这种能力可以通过练习来获得。在本视频演示中，我将逐步展示一些复杂手术操作的关键步骤，以补充文字描述。

动物从手术中恢复后，挑战在于如何正确插入乳酸传感器和光纤电缆。Jonathan 和我将演示在固定动物时如何用力得当，以插入这两种精密设备。最后，我们将展示如何通过实时调整刺激强度来优化脑电图（EEG）反应。

本实验使用表达对蓝光敏感的阳离子通道的转基因小鼠。该通道在大脑皮层神经元中表达。首先使用5%异氟烷和95%氧气进行诱导麻醉，随后以3%异氟烷和97%氧气维持麻醉状态。

从两眼之间沿颅骨顶部向后做一正中切口。用过氧化氢和无菌生理盐水清洁颅骨。定位并标记B点和Lambda点，以确定立体定位坐标，用于电极光遗传刺激装置的定位。先用高速牙科钻配合0.5毫米球形钻头预钻固定螺钉孔，再用0.7毫米球形钻头扩大钻孔。

使用带槽口的手动螺丝刀将电极螺钉旋入孔中，旋转约四到五圈，以达到所需的深度。用立体定位套管固定引导套管的位置，然后使用丙烯酸树脂水泥将其固定在颅骨和锚点上。为保持通畅，每个引导套管从手术时至实验开始前均应内置留置套管或金属芯。

将脑电图电极（EEGs）和引导套管定位在颅骨中后，用一层薄薄的牙科丙烯酸水泥将它们固定在一起。待水泥凝固后，将塑料连接器置于干燥的水泥堆上方，将来自脑电图导线末端的导线连接至塑料连接器上的触点，以防导线被水泥覆盖。然后，将肌电图导线穿过核肌，方法是将其滑入一支21号针头的针管内进行引导。

穿过肌肉，在导线穿出肌肉处的远端，用5-0尼龙缝线围绕这些导线打一个双外科结。使用反向切割P-3针和5-0尼龙缝线，以间断单个外科结的方式将为暴露肌肉组织而牵开的皮肤重新缝合。待MC刺激仪程序设置完成后，将其作为独立信号发生器运行，输出5伏特的二进制开关信号。使用BNC连接器将MC刺激仪连接至激光器的TTL使能电源单元。

通过带状电缆将激光电源单元连接至激光器。同时将激光器连接到起始光纤跳线的公头FC接头。将起始光纤连接至旋转接头。

换向光纤旋转接头起到换向作用。当动物在笼内活动时，旋转接头随之转动，以防止光纤电缆因旋转扭矩而断裂。使用塑料扎带将换向器固定在动物所处圆柱形笼子上方的金属支架上。

用一只手将小鼠固定在手掌下，以限制其活动。将小鼠头部置于实验者中指与食指之间。随后使用无菌的25号针头清除导管套管内的碎屑。

然后用手插入光纤，并用带螺纹的螺帽将其固定在光纤导向套管上。通过在光纤上距离平整切割末端固定距离处打结的缝合线结来控制光纤插入脑内的深度。传感器在磷酸盐缓冲液中进行平衡，并依次暴露于三种不同浓度的L-乳酸溶液中。

根据制造商的操作规程，将预先校准的传感器以与插入光纤电缆相同的方式插入颅骨固定的乳酸引导套管中。使用双极插头连接器将乳酸传感器连接到Pinnacle 8,400生物传感器的前置放大器。然后将该前置放大器连接到手术植入的头帽上的八针连接器。

在采集数据之前，使用激光强度控制旋钮调节光遗传学刺激的强度。由于尚未系统研究的因素，不同动物的脑电图（EEG）反应幅度会有所差异。因此，有必要调节光遗传学刺激的强度，并在达到理想反应时确认脑电图反应是否充分。

使用 Pinnacle 8, 400 系统结合神经评分采集数据。通过 SEIA 接口对脑电图（EEG）和肌电图（EMG）数据进行目视检查，以分类睡眠状态。根据 EEG 和 EMG 数据，将每十秒时间段内的数据分为清醒、非快速眼动睡眠或快速眼动睡眠。

该生物传感器光遗传学刺激配置显示了手术植入的脑电图电极、乳酸传感器以及用于光遗传学刺激的套管。在无光遗传学刺激的情况下，该小鼠经历了自发性睡眠。在持续监测脑电图-肌电图（E-E-G-E-M-G）和脑内乳酸浓度的同时，记录了清醒状态与两种睡眠亚型之间的状态转换。

根据脑电图（EEG）和肌电图（EMG）来定义快速眼动睡眠和非快速眼动睡眠。有趣的是，乳酸生物传感器电流随低幅值脑电图信号升高而上升，随高幅值脑电图信号升高而下降。脑电图的两个通道均对前额叶皮层施加的光遗传学刺激有响应。

观看本视频后，您应充分掌握如何对小鼠进行手术，以实现光遗传学操控与脑电图、肌电图及脑内乳酸浓度的同步测量。一旦熟练掌握，该手术技术可在90至120分钟内规范完成。请务必持续监测动物的呼吸情况，以此作为评估麻醉深度的指标。

如果动物呼吸频率低于每四到五秒一次，麻醉可能过深；如果呼吸频率高于每两秒一次，麻醉可能过浅。使用气体麻醉剂异氟烷时，请务必采取适当的安全防护措施。

确保手术室具有足够的通风，以保护您的视网膜免受光遗传刺激所用激光的伤害。应佩戴防护护目镜，或将动物置于避光柜中。您需要在完全清醒的小鼠身上练习乳酸生物传感器和光纤电缆的植入。

小鼠无法主动配合这些操作，必须进行固定。然而，固定方式不可过于用力，以免损伤动物或妨碍其呼吸。