人脑癫痫术后皮层组织的多电极阵列记录

本实验的总体目标是对人类癫痫皮层组织进行离体、发作间期及类发作事件的多电极阵列记录，从而在细胞和网络水平上研究癫痫活动的基本机制、发作起始与传播过程以及抗癫痫药物的作用效果。该目标的实现首先需要在手术过程中仔细切除药物难治性癫痫患者的人皮层组织；第二步是在切片前清除血凝块、血管、脑膜以及多余的白质组织。

接下来，将组织块切成400微米厚的切片。最后一步是将切片置于高氧合、温度可控且缓慢灌注的界面条件下孵育。最终，采用多电极阵列技术记录类似自发性癫痫样放电活动以及诱发的类似癫痫发作事件。

我们的实验室致力于研究神经胶质相互作用在脑部生理病理学中的作用，以探讨神经细胞如何在人体内产生病理性的网络活动。近期，我们与颈部护理医院和拉皮斯医院合作，建立了针对人类癫痫患者术后皮质组织的多电极阵列记录技术。今天，颈部护理医院的神经外科医生托马斯·布洛（Thomas Blo）、拉皮斯医院的癫痫学家兼研究员费尔德（Feld）以及我实验室的博士后研究员埃琳娜·DOI（Elena DOI）将向您演示如何开展并有效利用此类技术。

从人类癫痫组织的采集到离体条件下的多电极阵列（MEA）记录，利用人类皮质组织进行癫痫治疗（ECT）使得研究人员能够直接探索功能保持的人类癫痫神经元和胶质细胞，这些细胞以特定的网络形式相互连接。体外研究中，人类组织可提供对单个细胞及网络活动、离子机制的深入观察，而这些机制在体内研究中无法完全阐明。对人类皮质组织进行MEA记录有助于回答癫痫研究领域中的关键问题，例如癫痫发作起源的细胞机制以及癫痫放电传播的机制。

该技术对局灶性癫痫及其治疗具有重要意义，因为它有助于理解药物抵抗的机制以及抗癫痫药物对人脑皮层切片中记录的类发作事件的影响（体外实验）。与现有方法（如脑电图或体内微电极）相比，多电极阵列的主要优势在于，它能够以非侵入方式同时对组织的多个位点进行场电位和多单位活动的刺激与记录。

开始实验操作时，首先用蒸馏水填充界面式孵育槽的下部，然后将孵育槽连接至碳酰气源。接着，剪取一片滤纸以适配切片槽的平坦区域。

将其放置在进样管旁边，以便气泡在到达脑片前从进样管路中逸出。随后，剪取两段与镜头纸长度相同的绞合棉线，置于灌流 chamber 平面区域的两侧，并将蠕动泵的流速设置为每分钟 1 毫升。

随后开启腔室底部水体的氧合。然后将温度控制器设定为37摄氏度。用一块对二甲苯薄膜覆盖接口腔室的上部，并等待至少30分钟，使温度上升并稳定。

现在准备解剖工具，包括两把精细镊子、一把刮刀、一个小勺、一把刀片、两个玻璃培养皿、两把刷子以及氰基丙烯酸盐胶水。接下来，通过设置切片参数来准备振动切片机。在此步骤中，将预先配制的基于蔗糖的人工脑脊液从零下80摄氏度的冰箱中取出，并将其压碎成泥状。

用碳酰气（carbogen）对其进行氧合。然后将 250 毫升 A 型人工脑脊液冰浆转移至玻璃瓶中，并将其置于装有冰块的保温瓶内，用于手术室中的组织采集。在标准全身麻醉下，使用神经导航系统精确定位大脑皮层。

随后，在皮肤上做一切口，然后在颅骨上钻孔，接着进行开颅手术。接下来，轻柔抬起骨瓣，并用剪刀切开硬脑膜。随后对癫痫皮层进行整块切除，避免广泛电凝。

切下一厘米厚的皮层组织块，并将其放入冰冷的、含氧的蔗糖配制人工脑脊液（A CSF）中。随后，尽快将组织连同冰冷的蔗糖配制含氧A CSF一起运回实验室，注意避免机械震动。现在，用蔗糖配制的含氧A CSF冰浆填充培养皿和振动切片机的缓冲槽，并持续用碳合气（carbogen）为A CSF冰浆供氧。

然后用勺子小心地将组织从瓶中取出，并置于培养皿中。使用镊子仔细去除血凝块、血管和脑膜，以避免切片过程中产生阻力。用刀片切割组织的侧面，以获得与组织对侧尽可能平行的平整表面。

然后将组织粘附到振动切片机的样品板上，以制备横断面皮层切片。随后将其放入缓冲槽中，以低速切割成400微米厚的切片。接下来，用刮勺和毛刷切取几小片镜片纸。

将这些晶状体组织切片转移至界面式孵育槽中，在记录前于37摄氏度下孵育至少一小时。在此步骤中，将灌流系统连接至蠕动泵，将MEA系统连接至计算机。

然后将一个空的MEA芯片放入放大器中。接着，将MEA腔室中导管元件的温度控制器设定为37摄氏度。以每分钟5至6毫升的速度开始灌注含氧人工脑脊液（aCSF）。

然后，打开记录软件。确保所有MEA电极连接良好，并且灌流未引起噪声。现在将一些预热的记录用人工脑脊液倒入玻璃培养皿中。

用镊子夹取镜片纸，将切片从界面室转移到培养皿中。然后通过将镜片纸浸入溶液中，小心地使切片脱离镜片纸，或使用小刷子辅助分离。接着，用一些人工脑脊液（A CSF）填充MEA芯片。

使用带有塑料移液管的刮铲将脑片转移至MEA芯片上。轻轻吸去溶液，使脑片黏附于电极区域，并用铂金锚固定。随后，向MEA芯片中加入1毫升记录用人工脑脊液，并将其置于放大器中。

然后以每分钟5至6毫升的速度开始灌流。接下来，检查切片在MEA记录区域中的位置，必要时通过MEA监测软件进行调整。

为了记录皮层各层的信号并进行成像，开始记录。这是通过MEA电极记录的人脑皮层脑片活动的一个代表性轨迹。在正常人工脑脊液中，灌流无镁、含6毫摩尔钾的人工脑脊液15分钟后，可观察到类似发作间期的自发性活动。

首次发作出现后，每隔两到三分钟相继发生其他事件。蓝色轨迹显示了放大后的活动情况。该图展示了以250赫兹高通滤波的数据，放大后可观察到多单元活动，此处为无镁条件下所有MEA电极记录到的一次典型癫痫发作的代表性记录。

6 毫摩尔/升钾离子人工脑脊液。每个方格代表一个 12×12 多电极阵列（MEA）中的电极，并显示第 82 个时间窗口。虚线表示相对于 MEA 阵列的皮层表面位置。

观看本视频后，您应充分了解如何安全转运人脑皮层组织、制备并保存有活性的皮质类器官，以及记录自发性和诱发性癫痫活动的MEA（多电极阵列）信号。在实施该操作过程中，医院临床团队与实验室研究人员之间的密切协作至关重要。切勿忘记，操作人体组织可能存在生物安全风险，必须始终采取防护措施，例如佩戴手套，以避免可能的传染性疾病暴露。在本操作基础上，还可结合其他技术，如荧光成像、膜片钳记录、峰电位分选及组织学分析，与MEA记录相结合，以关联突触特性、单细胞行为、离子动态变化以及细胞与分子异常与群体电活动之间的关系。

对人类癫痫组织进行MEA记录可为研究人员探索病灶性癫痫提供途径，有助于阐明癫痫发生及药物抵抗的机制，以及神经元-胶质细胞相互作用在这一现象中的作用。感谢观看，祝您的实验顺利成功。