利用定制设计的电趋化室研究前列腺细胞的定向迁移
2014年12月7日
我们介绍一种在定制的电趋性室中对迁移中的永生化前列腺细胞施加生理电场的方法。利用该方法，我们证明了两株非致瘤性前列腺细胞在电场中表现出不同程度的迁移方向性。
本实验的总体目标是进行Galvan Axxis检测，以评估细胞在施加电场中的定向迁移能力。首先组装Galvan Axxis小室，并将目标细胞接种其中；第二步，密封小室并施加电场，进行延时成像。
在最后一步中，追踪单个细胞的迁移速度及其相对于电场的方向角度。最终通过余弦值来表示。该方法可用于展示细胞对电场的响应情况，以及它们是否朝向阴极进行定向迁移。
该技术的主要优势在于，经过给定的德克萨斯处理后，细胞易于回收，可用于二次分析；同时，迁移过程可在高倍镜下轻松拍摄，尤其是使用荧光标记细胞时。该方法的可视化至关重要，因为若无演示，很难掌握小室组装的步骤。组装底部小室时，首先用两份异丙醇擦拭塑料盖玻片腔室。
然后使用注射器在腔室底面的圆形开口周围涂抹船用级硅胶密封剂。将一块大盖玻片覆盖在密封剂上，并用棉签的一端将其压紧，同时用棉签擦去多余的胶水。接着使用金刚石笔在小盖玻片上标记，切割出六段每段25毫米的空隙，然后将腔室翻转过来。
接下来，使用注射器涂抹两条硅胶，于底部玻璃的两个圆形开口之间形成一个10乘以25毫米的通道表面，用于细胞贴附。然后在两个圆形开口之间粘合两片玻璃间隔片，用新的棉签向下压紧间隔片，并如刚才所示擦去多余的胶水。将培养腔室静置24小时，直至硅胶完全固化。
第二天，将腔室浸泡在蒸馏水中过夜，以去除胶水中的乙酸残留物，然后再向腔室内接种细胞。用异丙醇按前述方法将腔室擦干并擦拭两次。用无菌 PBS 洗涤三次，然后检查腔室两个圆形开口之间的液体流动情况。
确认小室处于良好工作状态后，将其放入无菌培养皿中，并于37摄氏度放置15分钟。在小室平衡期间，用5毫升胰蛋白酶EDTA在37摄氏度下将前列腺细胞从培养皿中消化下来。5分钟后，加入5毫升10%FBS中和反应。
在PBS中，将脱离的细胞转移至15毫升离心管中，然后离心5分钟。在200 × g条件下，吸除上清液，再用1毫升培养基重悬细胞沉淀。细胞计数后，用培养基将细胞浓度调整至每毫升8 × 10⁴个细胞，并进行接种。
将350微升细胞悬液加入每个腔室中。将细胞置于培养皿中，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下，在腔室内过夜培养，培养皿内放置湿润的Kim擦拭纸。次日，开始组装上层腔室，首先将每孔Galvan AXS腔室所需的10毫升培养基预热至37摄氏度。
当培养基预热时，将一个Galvan axxis培养室从培养箱中取出，置于37摄氏度的加热板上，并用培养基冲洗培养室。为去除未贴壁的细胞，在培养室内保留400微升培养基，然后使用注射器在两个玻璃间隙上方涂抹高真空润滑脂。用盖玻片和棉签密封培养室，随后干燥玻璃表面。
接下来，使用注射器将高真空润滑脂涂抹于盖玻片与腔室之间的缝隙以进行密封。然后向内侧储液池中加入培养基。去除气泡，并检查储液池之间的液体流动情况。
制备琼脂桥时，先截取一段两英寸长的PVC管，将其翻转后放入100毫升烧杯中。接着，将200毫克细菌琼脂加入含有10毫升培养基的50毫升锥形瓶中，配制成2%琼脂凝胶。微波加热30秒后，用移液管将琼脂凝胶注入塑料管中，并将琼脂桥在室温下静置10分钟，使其凝固。
然后向Gal chamber的外层储液室中加入两毫升培养基，并将琼脂桥插入内层和外层的介质储液室中，以传导电流，进行细胞迁移的延时成像。首先，将Galvan chamber转移至显微镜载物台上的37摄氏度环境培养箱中，用胶带固定装置，并在10倍物镜下对细胞进行聚焦。接着，将Galvan Axxis电极插入外层储液室中，将阴极置于右侧，用胶带固定导线和电极。
然后打开电源盒，对腔室施加电场，并使用电压表测量腔室两端的输出电压，使25毫米长的腔室达到2.5伏。现在选择腔室中10个点以生成10个延时录像，设置采集条件为每10分钟一次，持续两小时。随后开始拍摄，并根据需要调节输出电流，以在实验过程中维持电场强度。
实验结束时，将培养室从载物台上取下，用95%酒精固定细胞，然后打开培养室。盖玻片可保存以备后续使用。
染色与成像。清洁腔室以供将来使用。为定量分析Galvan Axxis，将延时电影旋转，使阴极位于图像顶部。
将视频导出至细胞追踪软件中，从每段视频的每个时间点手动追踪10到20个细胞的XY位置，测量迁移距离以及相对于南北方向的角度（与电场方向相同的取向），这些参数将在细胞追踪软件中进行计算。最后，保存测量结果并导入数据库应用程序以计算综合结果。在此项具有代表性的Galvan Axxis实验中，两条前列腺细胞的迁移速度在两小时内被确定为相近。
然而，PRNS 11 细胞系的电场方向性为 0.7 ± 0.3，而 PNT2 细胞系为 0.2 ± 0.8，表明这两种细胞系的伽伐尼轴存在显著差异，提示其细胞信号机制对电场具有不同的迁移响应。在建立伽伐尼-德克萨斯方法后，该技术有助于研究人员探索细胞在电场中定向迁移的机制。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本研究介绍了一种使用定制的电趋化室对迁移中的永生化前列腺细胞施加生理电场的方法。结果表明，两种非致瘤性前列腺细胞系在电场作用下表现出不同程度的迁移方向性。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞迁移
- 电生理学
- 前列腺癌研究
背景
- 电趋化性是指细胞在电场作用下产生的定向移动。
- 该方法有助于理解癌症研究中的细胞行为。
- 永生化前列腺细胞可作为研究非肿瘤性细胞行为的模型。
- 不同细胞系对电场的响应可能存在差异。
研究目的
- 评估前列腺细胞在电场中的定向迁移能力。
- 比较不同非致瘤性前列腺细胞系的迁移行为。
- 建立一种可靠的体外研究电趋化性的方法。
使用的方法
- 组装定制的趋电性实验腔室。
- 将永生化前列腺细胞接种至腔室内。
- 在延时成像过程中施加电场。
- 追踪单个细胞相对于电场的迁移速度和方向。
主要结果
- 两株非致瘤性前列腺细胞表现出不同程度的定向迁移能力。
- 细胞向阴极迁移，表明其对电场具有响应性。
- 对迁移速度和迁移角度进行了定量分析。
- 该方法有助于深入理解前列腺细胞在电场作用下的行为特征。
结论
- 趋电性实验腔是一种研究细胞迁移的有效工具。
- 不同前列腺细胞系在电场作用下表现出独特的迁移模式。
- 该研究有助于深入理解电场在细胞行为中的作用。
常见问题
行业重要性概述
该方法通过量化前列腺细胞对生理性电场的定向反应，实现对细胞迁移表型的机制性风险评估，从而支持早期发现阶段的靶点验证。定制的趋电性小室提供了一种可重复且与疾病相关的系统，用于评估细胞固有的迁移行为，通过揭示不同细胞模型之间的功能差异，为先导化合物的筛选策略提供依据。此类电生理特征分析通过在可控刺激条件下将细胞信号转导机制与功能输出相联系，增强了临床前模型的预测可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过揭示不同前列腺细胞系之间调控定向迁移反应的差异性内在特征，验证治疗假设。
- 操作价值：通过定量测量细胞迁移速度和相对于阴极导向的电趋化性角度，实现生物学风险的降低。
- 预测价值：通过识别调节电趋化性的细胞系特异性信号机制，支持项目组合的筛选，为靶点可信度评估提供依据。
筛选与检测方法开发
- 检测准备：采用低细胞毒性的可重复使用PVC腔室和铂电极，构建经过验证的生物系统，用于标准化的电趋性筛选。
- 定量输出：通过延时成像和细胞追踪软件生成细胞迁移速度和方向持续性等量化指标，实现对化合物的可靠评估。
- 可扩展性：通过琼脂桥介导的电流传导和电动载物台成像，支持平台重复使用，有助于不同实验批次间的检测标准化。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：采用SV40永生化的前列腺细胞系（pRNS-1-1和PNT2）作为与疾病相关的体系，用于在电生理信号下模拟非肿瘤性细胞的行为。
- 转化连续性：通过揭示差异性电趋化性，将发现阶段的电趋化测量结果与临床前风险校正的进展相联系，从而反映潜在通路的活性。
- 机制性风险降低：强调细胞信号传导机制如何引导细胞对电场产生差异性迁移反应，从而降低靶点验证中的不确定性。
流程与工作流整合
趋电性检测可融入从假设验证到先导化合物鉴定的整个发现流程，提供电生理读数，以补充基于生物化学和成像的筛选级联。
- 发现生物学：通过量化前列腺细胞系在施加电场中的定向迁移行为，支持假设验证，阐明通路依赖性迁移表型。
- 筛选应用：通过标准化的腔室组装、无菌平衡处理以及在可控电场强度（25 mm 腔室两端施加 2.5 V）下的延时成像，实现即用型检测流程。
- 分析功能：支持通过导出的延时视频、手动 XY 轨迹追踪，并计算相对于电场南北方向的迁移角度，进行比较分析。
- 转化研究：通过识别内在迁移差异，将电趋化结果与临床前研究衔接，预测细胞在复杂微环境中的不同响应。
- 企业级复用：由于组件成本低、可高压灭菌，且采用模块化设计，支持玻璃表面修饰和细胞处理，使该腔室具备可重复使用的能力。
运营与企业影响
- 科学价值：通过定量的电趋性指标，提高靶点验证的预测可信度，减少细胞迁移研究中的机制模糊性。
- 操作价值：采用密封腔室、琼脂桥和电动载物台成像实现标准化与可重复性，最大限度降低电趋性测量的变异性。
- 战略价值：通过揭示细胞系特异性的电趋性特征，为早期靶点项目的资金配置提供依据，从而做出更优的立项或终止决策。
- 组合影响：通过差异性方向性测量（例如 0.7±0.3 与 0.2±0.8）反映细胞内在迁移表型，实现基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 可靠的电趋性实验执行需要具备细胞培养、微流控腔室组装和延时显微镜技术方面的专业知识。
- 依赖于仪器设备，包括电动显微镜载物台、电压表和细胞追踪软件，以进行定量的方向性分析。
- 需要跨团队统一腔室密封操作规程（如硅胶涂布、琼脂桥制备），以确保电流传导的一致性。
- 在对玻璃表面进行改造或在腔室基底上测试细胞外基质涂层以研究细胞黏附时，需考虑相应的适应性调整。
- 存在一些实际限制因素，例如硅胶需要24小时固化时间，以及腔室需过夜浸泡以去除乙酸残留物后才能进行细胞接种。
