一种用于分析神经前体细胞在体外施加直流电场中迁移动力学的电趋性实验方法

本实验的总体目标是观察成年来源的神经前体细胞在直流电场存在下的迁移情况。首先从成年小鼠脑室下区分离并培养神经前体细胞，以实现这一目标。下一步是准备Galvan Axxis培养室，并将神经前体细胞转移至培养室中。

最后一步是在Galvan Axxis小室上施加直流电场，并进行延时成像，以观察神经前体细胞的迁移。最终，延时成像显微镜可捕捉神经前体细胞在分化和未分化状态下的电趋向性特征。尽管该方法可为神经前体细胞的电趋向性提供见解，但也可应用于其他系统，例如小鼠脑卒中模型，用于招募神经前体细胞至损伤部位，以促进神经修复。

本实验操作将由我实验室的研究生 Rob Pilley 演示。开始此操作时，神经前体细胞（NPC）必须已在培养中生长七天，以便悬浮的初级神经球已准备好进行收获。必要时，开始准备三个 Galvan Axxis 腔室，方法是放置三块方形玻璃。

第一步，将盖玻片放入装有6 mol/L盐酸的瓶中，浸泡过夜。次日一早，将Matrigel置于冰上缓慢解冻。四小时后，Matrigel即可用于构建培养腔室。

首先，使用金刚石尖玻璃切割器从新的方形盖玻片上切割出六条矩形玻璃条。将经过酸洗的方形盖玻片和矩形玻璃条转移至超净工作台中。

用70%乙醇清洗玻璃条，随后用组织培养级高压灭菌水冲洗。让其自然晾干，或在无绒纸上干燥。接着，在每块方形玻璃片的一个表面边缘涂抹真空润滑脂，并将其密封到60毫米塑料培养皿的底部。

培养皿。在矩形玻璃条的一侧涂抹真空润滑脂，并将其密封到方形培养皿相对的边缘上，使载玻片形成每个培养皿中央带有中央槽的方形区域。

在生物安全柜中对这些经过修饰的玻璃方片或培养腔室进行紫外线灭菌，至少持续15分钟。随后，将250至300微升的多聚赖氨酸（poly-L-lysine）滴加到腔室的中央槽中。然后将腔室在室温下孵育2小时，孵育结束前约15分钟开始进行下一步操作。

两小时后制备基质胶溶液，吸除多聚赖氨酸，并用一毫升高压灭菌水清洗中央槽。然后向中央槽中加入 250 至 300 微升基质胶溶液，将培养室置于 37 摄氏度孵育一小时。孵育结束后，吸除基质胶溶液。

然后用一到两毫升的无血清培养基（SFM）轻轻冲洗中央槽。现在，将100微升的E-F-H-S-F-M或F-B-S-S-F-M移液至中央槽中，以准备接种培养的细胞。接着，将四到五毫升含有神经球的培养物移液至一个新的60毫米培养皿中。

然后将培养皿置于计数显微镜的载物台上，使用5倍观察物镜。用P10移液器轻轻转移5到8个完整的神经球至每个腔室的中央槽内，最多四个。

神经球可立即转移，但不要将中央沟槽中的神经球进行解离。小心地将其分散至周围区域，避免破坏基质胶基质。然后向中央沟槽中再添加150微升E-F-H-S-F-M或F-B-S-S-F-M培养基。

现在将细胞置于湿润的培养箱中进行培养。培养17至20小时后，未分化的NPC将在培养69至72小时后获得。在培养过程中，分化的NPC也将可获得。

在解剖显微镜下，选择含有最佳细胞的培养腔室用于活细胞成像迁移分析。细胞应呈圆形，几乎完全从神经球中解离出来，且尚未或仅刚开始在培养皿中形成突起。准备一个腔室盖。

用70%乙醇清洗方形玻璃盖玻片，再用高压灭菌水冲洗，并在两条平行边缘涂上一圈真空脂。现在覆盖培养室。首先，吸出中央槽中的培养基，然后迅速将盖玻片像屋顶一样密封到矩形壁上。

接下来，利用毛细作用将 100 微升新鲜培养基加入中央槽中。现在使用真空脂为培养基池创建边界。在活细胞成像系统的中央槽两端，准备好琼脂糖凝胶管、银/氯化银电极以及两个 60 毫米的培养皿以供使用。

作为培养基储存区，将培养 chamber 置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳环境中静置 20 至 30 分钟。在此期间，使用 Dremel 工具或移液器在两个空培养皿的皿盖以及 Galvan Axxis chamber 培养皿的皿盖上钻孔，然后在中央槽的两侧各加入 1.5 至 2 毫升培养基，并在每个空培养皿中加入 7 至 8 毫升无血清培养基（SFM）。将一个培养皿置于 chamber 中央槽的每一侧，并在每个培养皿中放入一个电极。

通过在腔室与培养皿之间搭建连接，以建立电连续性。使用 Agros 凝胶桥将电极与外部电源连接，并串联一个 M 表以测量电流，然后开启电源。使用伏特表直接测量中央槽内电场的强度。

根据需要调整电源的输出。现在启动成像系统上的延时成像模块。在 Axio Vision 软件中选择多维采集并点击确定。

选择通道六，点击 T 开始时间序列成像。在设置中的“时间点前”和“时间点后”字段，将时间间隔设置为一分钟，持续时间设置为八小时。然后点击开始，让实验按所需时间运行。在完成检测后，继续进行免疫组化（IHC）分析。

运动学分析显示，在250毫伏/毫米的直流电场（DCEF）存在下，未分化的神经前体细胞（NPCs）表现出高度定向且快速的向阴极迁移运动；在此场强下，超过98%的未分化NPCs在成像的整个六至八小时内持续迁移。在缺乏直流电场（DCEF）的情况下，细胞则表现出随机运动。

由于死细胞不会迁移，这表明它们在此期间保持活性。无论是否存在A-D-C-E-F，分化表型的细胞均表现出可忽略的迁移，且在分化细胞的A-D-C-E-F亚群存在或不存在的情况下均如此。细胞突起延伸并倾向于垂直于DCEF方向排列，但未观察到明显的细胞体移位。

免疫染色证实，在直流电场暴露六小时后，神经前体细胞（NPCs）仍维持神经前体细胞标志物nestin的阳性表达。在诱导NPCs分化为成熟表型的实验中，经过六小时直流电场暴露后，大部分细胞表达成熟星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）。通过该实验流程，可利用基因敲除模型进一步探究将直流电场信号转导为细胞运动的细胞内机制。

或者先生，举个例子。