高效率诱导人多能干细胞分化为心肌细胞及通过流式细胞术进行表征

本实验的总体目标是从多能干细胞中生成高质量的心肌细胞培养物，并通过流式细胞术对终末产物进行适当的表征。为实现这一目标，首先建立高质量的未分化多能干细胞单层培养体系，随后通过小分子调节Wnt信号通路以诱导心肌发生。

接下来，使用针对每种抗体专门优化的条件对心肌细胞进行固定、通透和染色。最后，通过流式细胞术分析细胞。最终可获得结果显示，培养的细胞对心脏标志物TNNI3和IRX4高度阳性，并表现出类似心室的动作电位。

与现有的如员工和辫状体等方法相比，该技术的主要优势在于其实现相对简单且具有成本效益。此外，该技术所产生的细胞培养物对心肌肌钙蛋白 I 呈高度阳性。由于其他方案中存在内在变异性和效率差异，本方法的可视化演示至关重要，因为分化的前体细胞质量将显著影响分化效率。此外，抗体染色前若固定不当或通透处理不充分，将导致流式细胞术结果不理想。本实验操作将由我实验室的研究生 shabo bachar 演示。

以下操作流程中最困难的部分是在分化前维持高质量的未分化多能干细胞。使用生长特性次优的细胞会显著影响分化效率。本操作应从已在六孔人胚胎干细胞认证基质包被培养皿中良好培养的肝前体细胞（HPCs）开始。

在显微镜下检查细胞，确保其形态均一。如果细胞呈现如图所示的神经上皮样或成纤维细胞样形态，则不应使用。细胞在每孔75万个的密度下应能 robustly 增殖，大约每三天传代一次，当融合度达到75%时进行传代。在开始分化之前，需使用解离方法将细胞传至单细胞水平至少五次。

首先吸出细胞中的E八培养基，用4毫升预热至室温的PBS洗涤细胞两次。接着，向每孔加入1毫升室温的细胞解离溶液，静置培养板直至细胞边界开始变圆。此过程通常需要3至7分钟，可宏观观察，并通过显微镜确认。

接下来，使用带有棉塞的玻璃移液管和橡皮球吹打细胞，使其脱落，并将细胞转移至含有1毫升DMEM/F12培养基的15毫升锥形管中。这将使细胞解离溶液失活。取10微升细胞悬液，与10微升台盼蓝混合于微量离心管中。

计数细胞，然后将细胞收集到15毫升锥形管中，在130 ×g下离心5分钟。离心过程中，在室温下使用自动血细胞计数仪进行细胞计数。后续实验细胞活力预计为70%至80%。

细胞数量应基于总细胞数，而非活细胞数。离心后吸除培养基，将细胞沉淀重悬于D-M-E-M-F 12培养基中，调整终浓度为每500微升含0.75×10⁶个细胞，随后将0.5毫升细胞悬液加入六孔板的每个孔中，每个孔预先加入2毫升E八培养基。加入rock抑制剂后，轻轻前后及左右摇动培养板，使细胞在孔内均匀分散。

将细胞放回含5%二氧化碳、37摄氏度的培养箱中。包装后24小时开始，每天更换培养基，每孔使用2毫升E八培养基，不添加ROCK抑制剂。

优化接种密度，以确保在分化开始前达到100%融合度。第0天时，细胞应呈现100%融合、紧密的形态，且细胞碎片最少。通过将E八培养基更换为两毫升分化培养基，启动分化过程。

第一步，向每个孔中加入1.2 µL的CHIR。在第1天和第2天，通常会观察到明显的细胞死亡，比例可达40%至50%。然而，贴壁的细胞将保持紧凑的形态。

在此期间，培养基会变为橙色并浑浊。若观察到培养基呈粉红色，表明细胞死亡过多，应使用台盼蓝检测细胞活力，若细胞死亡率超过70%，则终止实验。否则，在第1天，重复更换培养基的操作，每孔加入2 mL新鲜分化培养基。第1天：每孔加入1.2 µL CHIR；第2至第3天，更换为新鲜分化培养基。

第一步，在第三至第四天期间，细胞将恢复，且密度在第四天增加。每孔更换为新鲜的分化培养基，即一号培养基和1微升IWR-1。

在第5至第6天期间，细胞死亡极少发生，且可能从第5天开始出现密集的细胞团块。在第6至第7天，更换为新鲜的分化培养基一，并向每孔加入1微升IWR-1。随后再次更换为新鲜的分化培养基一。

到第7至第8天时，细胞将形成融合的单层，呈现紧凑的形态，并分布有密集的细胞簇。到第8天，细胞将开始自发收缩，首次收缩通常可在这些密集的细胞簇中观察到。在第8天，更换为新鲜的分化培养基。

第二步，在整个培养期间，每隔一天继续更换分化培养基二号。到第10天时，可观察到更明显的收缩现象，并在随后的几天内持续扩散至整个培养物。本视频展示了第30天的细胞状态，此处显示的是第55天的细胞。

为进行流式细胞术的细胞收集，请按照之前的操作进行细胞解离、收集和计数。注意，此时细胞无需保持无菌状态。在轻柔涡旋细胞沉淀的同时，将100微升固定液逐滴加入细胞沉淀中。

然后将试管置于冰上孵育15分钟。加入3毫升细胞洗涤液，离心后收集细胞，边涡旋边吸除上清液。按照之前的方法，将100微升通透液逐滴加入细胞沉淀中。

然后将试管置于冰上孵育30分钟。加入3毫升细胞洗涤液。通过离心收集细胞，并吸除上清液。

透化后共进行两次洗涤。使用P1000移液器，加入400 µL细胞维持液至细胞中，并通过上下吹打使细胞分散，具体抗体染色步骤详见配套文件。接下来，用50 µL细胞维持液预润湿置于圆底管上的细胞筛网帽。

将离心管置于冰上。细胞筛网帽可防止细胞团块堵塞流式细胞仪。接下来，将细胞溶液转移至细胞筛网帽中，静置，使细胞悬液依靠重力自然滤过。

轻轻敲击离心管底部，使其贴在实验台面上，以便将细胞收集到管中。尽快将离心管放回冰上。用250 µL细胞维持液冲洗滤网，以确保最大程度回收细胞。

将细胞置于冰上并避光保存，直至通过流式细胞术分析，以确定所生成心肌细胞的质量。采用本方案，细胞分化培养10天后，使用针对TNNI3a（心肌细胞全标记物）、TNNT2a（横纹肌标记物）和IRX4A（心室心肌细胞标记物）的抗体进行染色。请注意，每种抗体的固定和通透条件均已优化，以获得最高比例的阳性细胞。

直方图显示，99%的门控细胞TNNI3呈阳性，96%的细胞IRX4呈阳性。此外，这些细胞对其他心肌细胞分化标志物也呈高度阳性，包括TNNT2、MLC2v和MLC2a。需要注意的是，关于心肌细胞纯度和细胞身份的结论是基于TNNI3和IRX4的表达情况。

MC2V和MC2A在发育过程中不受心室限制，而TNNT2也在骨骼肌中存在。此处所示的动作电位是通过全细胞膜片钳技术，在分化第46天从单个自发收缩的心肌细胞记录得到的。动作电位的特征表明已获得具有心室样特性的心肌细胞。

还观察到少量类似结节的结构。观看本视频后，您应能够充分理解如何从多能干细胞中生成高质量的心肌细胞培养物，并掌握通过流式细胞术对其进行表征的方法。通常，初次接触该技术的研究人员会面临一定困难，这主要是因为在启动分化之前，维持干细胞作为高质量单层细胞的培养过程中常会遇到一些挑战。

请注意，使用固定剂可能存在危险，且对个人有潜在危害。进行此操作时，应始终穿戴实验室外套、手套等个人防护装备。