利用多电极阵列（MEAs）对人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）进行电生理分析

本实验的总体目标是分离源自人多能干细胞的心肌细胞，并将其接种于多电极阵列上，以测量和量化其典型电信号（即场电位）的持续时间和频率。该方法有助于回答该领域的一些关键问题，例如携带突变的心肌细胞与对照细胞之间在电生理学上存在哪些差异。该技术的主要优势在于，可在源自患者细胞的人源心肌细胞上进行药物筛选。

该方法的可视化演示至关重要，因为解离和铺板步骤对于成功记录电信号必不可少。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为判断电信号质量优劣并非易事，且自由电位的分析需要经验积累。

开始此操作时，将洁净的芯片放入标准的直径10厘米的无菌塑料培养皿中。接着向培养皿中加入8毫升无菌蒸馏水，以形成一个加湿环境，防止芯片上的少量培养基在放入培养箱后发生干燥。然后使用定制的聚四氟乙烯（PolyTetraFluoroEthylene）环，确保将心肌细胞接种在芯片中央，即电极阵列所在的位置。

在超净工作台中，将环从乙醇中取出，放入无盖的无菌培养皿中，静置使其在工作台内干燥。然后用火焰灭菌的镊子将干燥的环放入MEA芯片内。

在圆环内加入50微升浓度为40微克/毫升的纤连蛋白，以包被电极。随后盖上培养皿盖子，小心地将含有MEA芯片的培养皿转移至培养箱中。之后，将含有MEA芯片的培养皿转移至细胞培养超净台中。

使用MEA芯片之前，用P200移液器或在通风橱中使用真空系统吸取50微升纤连蛋白，注意不要移动PTFE环。保持移液器枪头倾斜，避免任何固体接触电极。然后轻柔加入950微升LI-BPEL培养基，确保培养基均匀分布且PTFE环不漂浮。

随后将培养皿放回培养箱。这是跳动的心肌细胞的初始培养。在组织培养罩内，吸出hPSC-CMs培养孔中的培养基。

每孔加入一到两毫升不含钙和镁的 PBS 以洗涤培养物，然后吸除 PBS。随后，每孔加入 500 微升解离酶。将样品在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。

五分钟后，向每孔加入一毫升 LI-BPEL 以稀释酶。用 P1000 移液器轻轻刮擦，使 hPSC-CMs 单层细胞脱落。然后将细胞悬液收集至 15 毫升离心管中。

随后用一毫升 LI-BPEL 冲洗孔板，以收集所有残留的细胞和细胞团块。再加入两到三毫升 LI-BPEL，使终体积达到约五到六毫升，并用五毫升移液器轻柔吹打三到五次，以解离细胞团块。之后，在室温下以 300 × g 离心三分钟。

随后，去除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。然后将细胞沉淀重悬于 250 µL 的 LI-BPEL 中。接着，用移液器将 50 µL 细胞悬液直接滴加至电极阵列上方聚四氟乙烯（PTFE）环的中心位置，每个多电极阵列（MEA）分配一份细胞悬液。

将MEA小心转移至37摄氏度的培养箱中，使细胞过夜贴壁。铺板后一天，在无菌环境下使用无菌镊子小心取出环状物。用80%乙醇冲洗该环状物。

并将其放入含有80%新鲜乙醇的50毫升离心管中。接下来，从MEA芯片中轻轻移除500微升培养基，并向其中加入500微升新鲜的LI-BPEL。

取出环状物后的心肌细胞跳动情况如图所示。随后将微电极阵列（MEA）转移至37摄氏度的培养箱中。从取出环状物后第一天开始，持续一周，定期检测MEA上人多能干细胞来源心肌细胞（hPSC-CMs）的电生理活动。

现在启动与MEA装置相连的软件套件。接着，在TCX-Control中将温度设置为37摄氏度以记录测量数据。之后，从培养箱中取出含有MEA芯片的培养皿。

从培养皿中取出MEA芯片，放置在纸巾上以吸收残留的水分。用纸巾小心擦拭芯片外部，再用浸有100%乙醇的棉签清洁，以去除可能引起信号噪声的残留水分或碎屑。随后将MEA芯片转移至37°C的记录头期，以检测自发性电活动。

打开 MC Rack，点击“编辑”以加载 MEA 硬件。要创建新协议，请使用“编辑”下拉菜单向协议中添加不同的记录器和显示窗口。随后，通过点击播放按钮，以播放模式启动协议。

如果信号显示出清晰可见的R波和T波，则明显等待10至15分钟以完成适应阶段。开始实验时，单击“记录”，然后单击“播放”，在基线条件下采集10分钟数据，以确定稳态。标注出信号最佳的电极，以便后续能够轻松识别并导出用于分析。

进行药物反应评估时，每隔10分钟加入浓度递增的药物。在实验方案结束时，点击“停止”以结束记录。以下是使用微电极阵列（MEA）记录的代表性轨迹，显示质量良好的信号，RQ波和T波清晰可见，且信噪比较高。

一段质量较差的信号迹线，RQ峰和T峰不清晰可见；另一段为噪声较大的迹线，虽然RQ峰和T峰清晰可辨，但信噪比较低。以下是使用hPSC-CMs进行MEA实验期间记录到的不同形态的高质量场电位迹线的代表性示例。阴影区域表示在分析过程中测量的QT间期。

由于MEA上的场电位类似于动作电位的一阶导数，因此已计算场电位轨迹的积分，以理论模拟接近完整动作电位复极化的T波。在执行此操作时，需注意应尽可能使用电极数量最多的阵列，以确保信号的可靠性和一致性。完成此步骤后，可进一步采用其他方法，如定量胫骨时间PCR或单细胞膜片钳技术，以回答更多问题，例如与电生理表型相关的特定基因表达或特定离子电流密度。

该技术发展之后，为干细胞领域的研究人员探索心脏心律失常以及利用人多能干细胞衍生的心肌细胞进行体外药理学研究开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何将人多能干细胞衍生的心肌细胞解离并接种到微电极阵列（MEAs）上，以进行电生理学测量和药物筛选。请务必注意，操作药物可能具有极高危险性，在执行该实验流程时，应始终采取适当防护措施，例如遵循标准的优良实验室规范（GLP）。