趋化因子信号诱导的细胞与分子极化的快速稳健分析
2014年12月12日
趋化因子信号转导会引起细胞形态的显著改变以及细胞内蛋白质的重要重分布。本文提供了一种快速且详细的实验方案用于研究这些事件。
以下实验方案的目的是快速、自动地定量分析大量细胞在特定刺激下细胞形态的变化以及目的蛋白在亚细胞结构中的定位变化。该目标通过以下步骤实现：首先用感兴趣的趋化因子刺激T细胞；第二步，对细胞进行荧光标记，随后通过成像流式细胞术进行分析。
最后一步中，可根据每种染色所选掩模下像素的位置和强度，评估形态学极化的淋巴细胞数量以及荧光标记物的分离程度。最终，该成像流式细胞术可用于快速、可靠地定量分析趋化因子刺激后淋巴细胞的形态学变化，以及特定目的蛋白在极化细胞内的定位情况。与显微镜等现有方法相比，该技术的主要优势在于可重复处理大量细胞，并进行自动分析，从而确保对形态学变化和蛋白质分布的统计学分析具有较高的可靠性。
在趋化因子刺激的T淋巴细胞中，Boche kind T细胞刺激实验首先将每种实验条件下五次重复的细胞在含有10毫摩尔HEPES的温热HBSS中洗涤，340 × g室温离心5分钟。移除上清液后，将沉淀重悬于每管0.3毫升的温热HBSS中。随后将细胞悬液转移至各自的1.5毫升微量离心管中。向每管加入10至500纳克/毫升的趋化因子，然后反复翻转混匀。
将细胞置于37摄氏度水浴中孵育。8到10分钟后，加入0.3毫升含10毫摩尔HEPES的温热2%多聚甲醛终止极化。
然后通过反复翻转混匀各管，并在37摄氏度下继续孵育5分钟，以对细胞进行免疫荧光染色。接着，将刺激后的T细胞转移至相应的流式细胞术检测管中，用染色缓冲液完全充满各管。
然后离心细胞，并将沉淀重悬于100 µL含5%胎牛血清的PBS中。每管加入5 µL ZI N-T-H-L-A-A-B-C。涡旋混匀后，将细胞在室温避光孵育30分钟。孵育结束后进行后续操作。
用清洗液洗涤细胞两次，然后在500 µL的1%多聚甲醛中孵育细胞。10分钟后，用更多染色缓冲液洗涤细胞，随后用透化缓冲液完全充满离心管。用透化缓冲液再次洗涤细胞两次后，弃去上清液，然后涡旋振荡以充分分散细胞沉淀。
现在用0.25 µg/mL的Trixi染色样品，涡旋混匀，然后在室温避光条件下孵育30分钟。孵育结束后，用通透缓冲液洗涤细胞。再次重悬。
将沉淀物重悬于 200 µL PBS 中，然后将细胞转移至各自的微量离心管中，以确定趋化因子刺激后极化 T 细胞的百分比。首先打开成像流式细胞仪，并根据制造商的说明让其自动校准。绘制直方图，量化从基于 RMS 梯度选定的合焦群体中获得的 RMS 梯度值。
直方图描绘单个细胞群体在微离心管插入仪器后所得的面积直方图，调节单个细胞的激光功率步态，并获取 5,000 个 T 淋巴细胞。在 Ideas 分析软件中，打开所获取的文件，然后创建一个直方图，显示每个单独细胞所获得的明场图像的梯度均方根（RMS）值，并对表现出 RMS 梯度值高于 57 的细胞绘制门控。
在分析菜单中，基于明场图像 M zero one 的形态学掩膜，创建一个名为 erode M1 two 的新掩膜，该掩膜经 2 像素腐蚀处理得到。然后在分析特征菜单中，基于上一个门控步骤中生成的细胞，在 erode M1 two 掩膜上创建一个新的细胞面积特征。打开一个显示细胞面积的直方图，使用此新创建的掩膜，在单个 T 细胞上绘制门控，排除小面积区域中的校准微珠和碎片，以及大面积区域中的双联体细胞。
然后打开分析掩膜菜单，基于 H-L-A-A-B-C 染色的原始最大值与 Phin 染色的原始最大像素值的关系，生成一个新掩膜，命名为“erode M two two”，该掩膜来自 H-L-A-A-B-C 染色细胞的形态学掩膜，并进行 2 像素的腐蚀处理。接着在分析特征菜单中，创建一个新特征，该特征为在 erode M two two 上计算得到的圆形度参数。
随后创建另一个直方图，用于报告先前设门细胞的圆形度特征值。接着观察未刺激细胞直方图的形状，对极化细胞设门，从最低的圆形度值开始，直至大多数未刺激细胞所分布的圆形度阈值，以评估细胞内肌动蛋白染色的极化情况。此外，还需创建一个明亮细节相似性R3值的直方图，用于比较HLA-ABC和foid染色情况。
然后采用与上述相同的设门策略，并对未刺激细胞进行非共定位的分离染色分析。统计图面板显示此处具有极化肌动蛋白染色的T细胞百分比。图中展示了经CCL19刺激后落入非极化或极化细胞门内的T淋巴细胞示例。
两种亚群之间的形态学差异可以明显观察到。上述分选策略也可用于绘制在有或无CCL19存在条件下落入极化门控的细胞百分比。正如预期，趋化因子刺激可增加极化T细胞的比例。
在两种条件下获得的整个细胞群体的平均圆形度指数也可以进行绘图。事实上，CCL 19 刺激会引起该指数的下降。然而，由于仅有半数细胞发生极化，因此在 CCL 19 刺激后观察到的平均圆形度指数变化较小。
在本实验中，T细胞被共转染了GFP以及编码极性复合物par六的显性负性突变体的质粒PKC ζ。未转染细胞的直方图可用于对GFP阳性T细胞进行特异性设门，表明仅有小部分整体细胞群体被成功转染。
随后通过仅测量GFP阳性细胞的圆形度指数以及T细胞的另一种步态参数，对这些转染细胞的形态极化程度进行量化。圆形度值较低的情况被用来估算在每种条件下极化细胞所占的百分比。这些数据共同表明，破坏Par6-PKCζ信号通路的功能会抑制由CCL19和CXCL12趋化因子诱导的T细胞极化。
与先前的研究结果一致。在进行该操作时，必须在整个溶解性激酶刺激步骤及随后的固定过程中始终保持 37 摄氏度，以确保淋巴细胞形态极化的强度和可靠性。
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概述
本方案概述了一种在趋化因子刺激后定量分析T细胞形态变化和蛋白质定位变化的方法。该方法利用成像流式细胞术对大量细胞群体进行快速分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 免疫学
- 定量成像
背景
- 趋化因子信号传导影响细胞形态。
- 细胞内蛋白质的重新分布对细胞功能至关重要。
- 传统显微镜方法在通量方面存在局限性。
- 成像流式细胞术可实现对大量细胞的自动化分析。
研究目的
- 通过趋化因子刺激后定量分析淋巴细胞的形态学变化。
- 评估特定蛋白质在极化细胞内的定位情况。
- 通过高通量处理提高统计分析的准确性。
使用的方法
- 用趋化因子刺激T细胞。
- 细胞的荧光标记。
- 通过成像流式细胞术进行分析。
- 细胞形态和蛋白质分隔的评估。
主要结果
- 快速定量极化淋巴细胞。
- 荧光标记分布的评估。
- 形态学变化的统计学稳健分析。
- 与传统显微镜方法的比较。
结论
- 成像流式细胞术在分析细胞形态方面具有高效性。
- 该方法有助于深入理解趋化因子信号传导的作用效果。
- 它能够高效地对大量细胞群体进行研究。
常见问题
行业高管相关性
该方法可实现对趋化因子诱导的细胞极化及蛋白质重分布进行高通量定量分析，解决了免疫调节药物研发中靶点验证的关键瓶颈问题。通过在数千个细胞中自动化地进行形态学和共定位分析，该方法提高了对趋化因子受体通路早期阶段机制性风险评估的预测可信度。该策略支持对化合物在细胞极性上作用的可扩展、可重复的评估，直接为临床前项目组合筛选中的立项/终止决策提供依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过定量测量肌动蛋白极化和磷酸化ERM蛋白的区隔化，作为信号通路激活的功能性读出指标，从而实现对趋化因子受体信号转导假说的验证。
- 操作价值：基于大规模细胞群体提供统计学上稳健的数据，降低变异性，提高对靶点结合评估结果的可信度。
- 转化价值：通过将受体刺激与明确的细胞骨架重排联系起来，在进行后续投入之前阐明其生物学功能，从而支持机制层面的风险降低。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：建立了一种基于成像的定量极化检测方法，可同时捕捉细胞形态变化和蛋白质重分布，从而实现对化合物效应的多参数分析。
- 操作价值：采用成像流式细胞术，每种条件下可处理5,000多个细胞，并通过自动设门确保检测在不同实验间的标准化和可重复性。
- 转化价值：生成可扩展、可多重检测的读数，适用于趋化因子靶向筛选项目中的苗头化合物验证和先导化合物优化。
转化与临床前研究
- 科学价值：可用于评估抑制性化合物（例如肌动蛋白聚合阻断剂）和基因扰动（例如 Par6/aPKC 突变体），为通路特异性的风险评估提供与疾病相关的实验体系。
- 操作价值：能够在同一样本内对极化与非极化亚群进行并行比较，提高内部对照水平和数据可解释性。
- 转化价值：通过将形态学极性与亚细胞蛋白分隔相关联——后者是功能性趋化因子应答的标志性特征——支持转化生物标志物的匹配与验证。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点验证到先导化合物鉴定的整个发现流程，架起了生化受体结合与功能性细胞表型之间的定量桥梁。它能够早期评估化合物是否不仅调节受体结合，还调节对免疫细胞功能至关重要的下游效应机制。
- 发现生物学：通过量化形态极化和蛋白质共定位作为趋化因子受体信号传导的直接输出，阐明原代淋巴细胞中的通路活性，支持假设验证。
- 筛选：通过标准化的染色、刺激和成像流式细胞术方案实现检测就绪，生成用于化合物筛选的定量圆形度和共定位指标。
- 分析：提供均方根梯度、面积、圆形度和共定位读数，支持对不同条件及化合物对细胞极性影响的统计学比较。
- 转化研究：通过建立与疾病相关的读数（肌动蛋白/磷酸化ERM蛋白的区隔化），反映体内极化事件，连接早期发现与临床前研究的连续性。
- 企业级复用：作为模块化、即插即用的技术能力，适用于免疫学和肿瘤学团队研究趋化因子驱动的细胞迁移，可适配多种刺激条件和读出方式。
运营与企业影响
- 科学价值：通过直接、多参数可视化趋化因子受体信号通路中的极化事件，减少机制上的模糊性，从而提高预测的可信度。
- 操作价值：借助自动成像流式细胞术分析实现标准化和可扩展性，最大限度降低操作者偏差，并支持在不同实验场所间一致执行。
- 战略价值：通过提供对功能通路调控的早期定量洞察，改善“推进/终止”决策，减少因未预料到的生物学复杂性导致的后期研发失败。
- 项目组合影响：基于候选分子诱导或抑制真实细胞极化表型的能力，实现对趋化因子靶向候选物的风险调整后优先排序。
实施注意事项
- 需要具备成像流式细胞术操作、补偿以及基于掩模的形态学和荧光参数分析的专业知识。
- 依赖于成像流式细胞仪设备及配套软件，用于特征提取（如均方根梯度、圆形度、共定位等）。
- 需要在不同操作者之间对细胞刺激、固定和染色方案进行标准化，以确保极化读数的可重复性。
- 需针对每种细胞类型和刺激物优化趋化因子浓度和孵育时间，以避免过度或不足刺激带来的假象。
- 仅适用于可耐受成像流式细胞术剪切应力的贴壁细胞或悬浮细胞；对于脆弱或活力不足的原代样本，未经优化则不适用。
