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向全血样本中加入特异性抗体复合物,这些复合物靶向除中性粒细胞以外的血细胞。
加入可与抗体复合物结合的血细胞结合的磁性颗粒。
将免疫磁珠标记的样本转移至微流控芯片的细胞加样口。
将磁性圆盘连接到细胞加样口。
磁场吸引带有免疫磁性标记的细胞,使其被捕获在端口的侧壁上。
中性粒细胞未被标记,流入芯片后会被捕获在细胞停靠区域。
加入荧光标记的趋化剂溶液和迁移培养基至指定的储液池中。液体流经微流控通道,形成浓度梯度。
当趋化因子与中性粒细胞受体结合后,会触发细胞内变化,导致中性粒细胞重组其细胞骨架并伸出伪足。
这些伪足如同脚一样,推动中性粒细胞向趋化因子浓度更高的区域移动——这一过程称为趋化作用。
采用适当的显微镜技术监测中性粒细胞对趋化因子梯度的迁移反应。
从装置中移除去离子水,并从出口处加入 100 微升纤连蛋白溶液。等待三分钟,确保所有通道均被纤连蛋白溶液充满。然后将装置置于培养皿中(加盖),在室温下孵育一小时。
接下来,从装置中移除纤连蛋白溶液,并从出口处加入 100 微升迁移培养基。再次等待 3 分钟,以确保所有通道均已被迁移培养基填充。在用于趋化实验前,将装置于室温孵育 1 小时。取 10 微升全血加入 1.5 毫升离心管中。然后,加入 2 微升中性粒细胞分离试剂盒中的抗体混合物以及 2 微升磁性颗粒,轻轻混匀试管,以对带有抗体标记的细胞进行磁性标记。将标记混合物于室温孵育 5 分钟。
接下来,将两个小型磁性圆盘分别固定在装置的细胞加样口两侧。吸出装置所有加样口中的培养基。然后,从细胞加样口缓慢加入2 µL标记的血液混合物至微流控装置中。将微流控装置置于温度控制的显微镜载物台上,温度设置为37 °C。等待数分钟,直至有足够数量的中性粒细胞被捕获在细胞停靠区域。
接下来,使用两个移液器将100微升趋化因子溶液加入含有100微升迁移培养基的指定进样储液池中。这将通过基于连续层流的化学混合形成趋化因子浓度梯度。趋化因子可以是重组蛋白(如FMLP),也可以是临床样本(如慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者痰液的上清液)。
待流动稳定后,采集通道中FITC葡聚糖浓度梯度的荧光图像。随后,将装置置于温度可控的显微镜载物台上,或常规细胞培养孵育箱中孵育15分钟。孵育结束后,使用10倍物镜对梯度通道进行成像,记录细胞的最终位置,用于数据分析。