基于成像的流式细胞术技术评估粒细胞功能变化 体外

本实验的总体目标是采用双参数方法评估粒细胞功能。首先，将患者血液样本中的粒细胞与生物微粒及试剂共同孵育，以可视化其氧化爆发反应；在第二步中，终止孵育后阻断吞噬作用，随后标记目标细胞表面受体，从而实现对粒细胞的准确鉴定。

最终，可通过基于图像的流式细胞术对活化的粒细胞亚群进行鉴定和分离。该方法有助于回答营养学或临床免疫学领域中的关键问题，例如饮食习惯和营养行为如何影响粒细胞的功能变化。本实验操作将由我实验室的博士生 Eric Prado 进行演示。

获得外周血样本后，在室温下解冻SIUs生物颗粒和DHE，并将乙基马拉明置于37摄氏度水浴中。当试剂完全解冻后，在无菌操作台内向四个独立的1.2毫升离心管中各加入20微升ssus生物颗粒。然后向每支含有生物颗粒的离心管中加入40微升解冻后的DHE，轻轻敲击管壁，使试剂沉降至管底。向每支离心管中加入100微升混合全血后，用带棉头的涂抹棒清除管内壁边缘可能存在的污染血液，并使用电子移液器设定三个循环，充分混匀血液与试剂。

第三次循环结束后，将所有试管置于避光的冰桶中。然后将试管放入37摄氏度的摇床中孵育10、20或40分钟，从孵育40分钟的试管开始，以确保所有孵育同时结束。孵育结束后，向每支试管中加入15 µL乙基马拉梅德。

孵育30分钟后，向细胞中加入适量抗体各10 µL。继续孵育1小时后，向细胞中加入750 µL白细胞固定红细胞裂解液。再经过1小时孵育后，离心细胞，用真空抽吸法移除上清液，保留细胞沉淀上方100 µL的残留液体。

现在向每个样本中加入10 µL新稀释的七A a d、50 µL PBS和25 µL校准微球。然后盖紧管盖，用铝箔包裹，并在4°C下保存。当基于图像的流式细胞仪准备就绪后，运行每个样本管，使用预设参数收集至少3000个ULU位点事件以分析样本。

使用 IDEA 软件的自动补偿向导对原始图像文件应用补偿矩阵，并生成已补偿的图像文件。然后在 IDEA 软件中加载各个 CIF 文件，并生成以下图谱，以鉴定每位患者样本中的粒细胞亚群。首先以未刺激对照作为参考标准，利用明场梯度均方根直方图设定初始门控，识别被认为处于焦点内的细胞。

然后，为了将单细胞与碎片及双细胞分离开，创建明场长径比与明场面积的散点图。在鉴定出清晰的细胞群体后，建立CD45与CD66B的散点图，以明确鉴定CD45阳性且CD66B阳性的粒细胞。最后，创建金黄色葡萄球菌的明场细节强度与氧化爆发的明场细节强度的散点图。

为了鉴定活化的粒细胞亚群，需采集第一和第九通道的明场图像、第三通道的生物颗粒、第四通道的DHE、第五通道的7-AAD、第十一通道的CD66B以及第十二通道的CD45。此外，还可生成双色叠加图像，以显示DHE与生物颗粒事件的共定位。利用基于图像的流式细胞术，可将均一的活化粒细胞群体进一步分为三个不同的活化亚群。该方法中，区分这三个亚群最有效的方式是绘制吞噬作用的明场细节强度与氧化爆发之间的散点图。

在 IDEAS 软件中进一步使用共定位向导，可对粒细胞同时发生的吞噬作用和呼吸爆发进行定量分析，这是高活性的显著标志。此外，在本实验中，40 分钟的孵育时间显示出最高比例的高活性粒细胞。因此，在方案中包含至少三个孵育时间点，有助于确定特定临床治疗如何改变粒细胞的时序性活化状态。

完成此操作后，可进行其他方法，如基于微球的多重检测，以回答更多问题。例如，颗粒细胞趋化因子在仰卧位血清中暴露于生物颗粒后会发生怎样的变化？