评估视网膜小胶质细胞的吞噬功能 体内 使用基于流式细胞术的检测方法

本实验的总体目标是评估视网膜小胶质细胞在体内的吞噬功能。该方法有助于回答眼科领域的一些关键问题，例如特定化合物是否在生理条件下改变小胶质细胞的吞噬功能。该技术的主要优势在于采用流式细胞术，能够对小胶质细胞的吞噬作用进行快速而精确的定量分析。

为我演示该操作的是来自我实验室的博士后Susumu Sakimoto。首先，用33号针头和注射器吸取0.5 µL荧光标记的颗粒溶液。然后将麻醉小鼠侧卧置于柔软材料上，在手术显微镜下固定，并通过脚趾夹捏无反应来确认其处于适当的镇静水平。

接下来，使用镊子小心地对一侧眼睑周围施加压力，使眼球略微从眼窝中突出。然后用两根手指捏住动物耳部上方和下颌处的头部，轻轻沿眼睑方向拉伸皮肤，以保持眼球略微突出于眼窝外。玻璃体内注射操作难度较高，若操作不当，将导致结果出现偏差且重复性差。

为减少对眼睛的损伤，应将动物保持在稳定的位置，尽量减少头部移动。穿刺眼球时，用一只手轻轻抓住小鼠，然后找到角膜与巩膜连接处的角膜缘，在有色小鼠中表现为可见的灰色环状结构。

用另一只手握住注射器，将针头插入巩膜缘。然后稍微回撤针头，排出少量玻璃体液，再缓慢推动活塞以注入颗粒。当所有微珠完全注入后，缓慢拔出注射器，以避免注入物质反流，并在眼球复位后滴加保湿滴眼液以保持眼部湿润。

然后将动物放回其笼子中的加热垫上，并持续监测直至完全恢复。玻璃体内注射后3小时，使用45度角的镊子轻轻按压眼睑以使眼球突出。将镊子置于眼球后方并轻轻牵拉。

然后将眼球转移至培养皿的干燥区域，在解剖显微镜下用含有钙和镁的少量 PBS 浸润。使用超细镊子的一端在角膜缘处穿刺眼球。接着，用精细的45度角镊子夹住眼球，用弹簧剪刀沿角膜缘剪开，直至大约剪切一半周长。

将眼球转移至 PBS 中，使用另一把精细的 45 度角镊子撕开角膜和巩膜。晶状体和视网膜将完整地取出。确保晶状体与视网膜分离，然后将视网膜转移至一个含有 2 毫升含钙和镁 PBS 的 5.4 毫升聚苯乙烯试管中。

为了获得视网膜细胞的单细胞悬液，根据制造商的说明使用神经组织解离试剂盒，并将细胞重悬于200 µL染色缓冲液中。然后将样品转移至96孔U型底板的一个孔中。离心后，将平板倒置以弃去上清液，并在每孔中加入含CD16、CD32抗体的25 µL染色缓冲液，在室温下孵育5分钟以阻断Fc受体。

接下来，在室温避光条件下，用目标抗体对细胞进行标记，孵育15分钟。然后离心收集细胞，并在每孔中加入200 µL新鲜染色缓冲液洗涤一次。随后将细胞沉淀重悬于200 µL染色缓冲液和活性染料中，转移至1.2 mL微量滴定管中。

然后用额外的100微升染色缓冲液和活性染料洗涤各孔，并将洗涤液与相应的样本合并，用于流式细胞术分析。该方法可用于出生后10至20天的幼鼠或成年小鼠，并可进行调整以检测化合物的作用和/或小胶质细胞吞噬作用的遗传操控。例如，在本实验中，经腹腔注射不同剂量的LPS刺激后，与对照组（给予载体）相比，1.42毫克/千克剂量的LPS可诱导吞噬性小胶质细胞百分比出现具有统计学显著性的升高。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在六小时内完成。通过此方法，可进一步采用细胞分选结合qPCR或蛋白质组学分析等其他技术，以探究视网膜中吞噬性与非吞噬性小胶质细胞之间的差异。在建立该技术的过程中，我们期望能够使视觉与神经科学领域的研究人员得以在生理相关的情境下，原位深入探索小胶质细胞的吞噬功能。