近红外光可提高小鼠前庭感觉上皮中线粒体功能标志物的表达

以下实验的总体目标是研究近红外光对小鼠前庭感觉上皮可能具有的神经保护作用。该研究通过在小鼠不同发育阶段进行简单、短期的经颅近红外光照射来实现。第二步是解剖经处理动物的骨迷路，以分离前庭感觉上皮。

接下来，通过逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）检测目标抗氧化基因的表达，以评估该处理对线粒体功能的影响。最后，通过密度测定分析短时间近红外光处理对小鼠特定抗氧化基因表达的影响。这种近红外光处理技术的主要优势在于其操作简便且无创，可在处理后继续进行后续的生理学、分子生物学及行为学分析。

该技术的应用前景包括在正常衰老过程中对周围前庭系统的潜在神经保护作用，或在前庭系统疾病或功能缺损后改善平衡能力。实验开始前两到三天，尽可能贴近皮肤剃除每只小鼠头颈部的毛发，以防止在治疗方案完成前动物毛发重新生长。为维持动物的无病原状态，每次剃毛后需用70%乙醇清洁器械。

然后在每次对动物进行治疗时，抓住小鼠尾巴的近端，将其置于一只手的掌心，使其放松，以尽量减少近红外治疗组动物的应激反应。对每只动物，将670纳米的LED装置置于 shaved 区域上方一至二厘米处，开启装置照射90秒。对于假手术组，以相同方式重复治疗操作，但装置保持关闭；对于近红外阻断组，治疗操作与近红外治疗组相同，但将装置用铝箔覆盖。

在连续五天内，每隔24小时对每组小鼠重复一次处理后，将新配制的基于甘油的人工脑脊液（A CSF）置于-80摄氏度冰箱中冷冻45分钟，直至形成冰浆。接下来，对每只小鼠，使用钝头22号刀片沿颅骨矢状皮肤切开，期间持续用冰冻A CSF滴加于组织表面，以尽可能保持颅骨、脑组织及下方前庭器官处于低温状态。然后，使用标准剪刀的尖端在Lambda点处的颅骨上做一个小切口，并沿矢状缝剪开。

然后将浅U形牵开器的一臂轻轻滑至顶骨下方，再将顶骨向外侧牵拉，同时将枕骨向后牵拉，直至暴露脑组织。接着使用小型不锈钢刮匙将脑组织从前颅窝和中颅窝抬起。为暴露前庭耳蜗神经，需切断该神经，以避免对直接支配前庭毛细胞的初级传入轴突造成不必要的张力。

然后整体取出脑组织，观察位于颅中窝内包含耳蜗和周围前庭器官的骨迷路。现在在每侧骨迷路旁做两个小切口，抓住并向外牵拉前半规管，以切除整个结构。随后立即将切除的迷路浸入含有冰冻人工脑脊液（A CSF）的解剖皿中，并持续用碳氧混合气（carbogen）灌注。

该操作过程中最困难的部分是为每只动物获取数量一致且具有活性的组织，我们建议通过练习并仔细观察组织，在特定光照条件下进行操作。接下来，在体视显微镜下，用镊子夹住耳蜗以固定迷路，并使用直头精细镊子将组织固定在培养皿底部。在前半规管上方的骨质处轻轻刮开一个小开口。

然后立即伸至骨性结构下方，向外侧轻弹，以轻柔扩大开口。以此方式继续操作，直至前庭、前半规管和外半规管均完全暴露。随后使用精细镊子轻轻将前庭和半规管从骨迷路分离并提起，直至完全脱离。

最后，用镊子尖端牢固夹住前庭器官，并将其放入新配制的裂解缓冲液中，缓冲液置于带螺口盖的微量离心管内。轻轻晃动镊子，使前庭器官从镊子上脱落。随后在体视显微镜下确认镊子上无残留组织，旋紧微量离心管管盖，并立即将样品置于液氮中冷冻，以比较近红外处理对年轻与年老小鼠的影响。

信使RNA被逆转录为互补DNA，随后通过密度测定法分析抗氧化酶超氧化物歧化酶1（SOD1）的表达水平。与年轻假照光动物和年轻近红外阻断动物相比，年轻近红外照射动物中经β-肌动蛋白归一化的SOD1表达量显著增加，超过两倍。与老年近红外阻断动物相比，老年近红外照射动物的SOD1表达也上调了两倍以上。在此操作之后，可进一步开展行为学、分子或生理学实验，以回答其他问题，例如：近红外光是否增加前庭感觉上皮中其他基因或蛋白的表达？

或者近红外光能否改善经处理小鼠的整体平衡能力？