三维成像与分析人表皮内神经纤维中的线粒体

本成像与分析技术的总体目标是从复杂信号中分离出特定信息。具体而言，本方案描述了如何在表皮内对神经特异性线粒体与其他线粒体进行可视化和定量分析。该方法有助于回答神经学领域中的关键科学问题，例如健康个体表皮内神经纤维中的线粒体与患有神经系统并发症患者的神经特异性线粒体之间有何差异。

该技术的主要优势在于，我们能够从一个复杂的信号中提取出特定的信息。本方案可帮助我们分离出特定信号，例如从周围信号中分离出这些吸管中的信号。首先根据此示意图标记一个96孔板，以准备进行皮肤活检样本的荧光免疫组织化学染色。

然后，用移液器向96孔板顶行的每个孔中加入150微升储备信号增强溶液，以减少二抗的非特异性结合。通过向第2行和第3行的每个孔中加入150微升1×磷酸盐缓冲液，制备洗涤孔。然后，向第4行各孔中加入150微升5% BSA封闭溶液。

将一抗 PGP9.5 和 PDH 用 1% BSA 洗涤液稀释至 1,500 微升，并向第五行的每个孔中加入 150 微升。使用接种环将组织切片转移至第一行的信号增强液中。当组织切片置于第五行的一抗溶液后，用实验室封口膜紧密包裹整块板，防止蒸发，然后在室温下于水平摇床上振荡孵育一小时。

在4°C下振荡孵育过夜。实验第二天，将150微升1% BSA洗涤液加入96孔板的第六、七、八行孔中。将荧光素标记的二抗加入1,500微升1% BSA溶液中。

然后将150微升的二抗溶液加入到第九行的每个孔中。通过第六、第七和第八孔对切片进行清洗。当切片进入第九行的二抗溶液后，用封口膜包裹整个板，并用铝箔纸覆盖，以保护荧光信号。

同前法在摇床上孵育。第3天，用移液器将150微升无菌过滤的1×PBS加入第10、11和12行，将样品转移至第10行，然后用铝箔覆盖板子。

在室温下轻轻振荡冲洗一小时。接着，通过移液将50微升过滤后的1×PBS滴加到载玻片上，以制备用于封片的显微镜载玻片。冲洗完成后，将第12行的一个切片转移至载玻片上，然后直接在切片上滴加一至两滴含DAPI的封片剂。

将一块 50 毫米 × 24 毫米的 1.5 号显微镜玻璃盖玻片轻轻覆盖在切片上。将载玻片置于暗处，室温下过夜，使封片介质充分固化，然后进行储存或成像。在倒置激光扫描共聚焦显微镜上选择 40X 油镜物镜。

选择适当的激光器和探测器以成像细胞核、神经纤维和线粒体。在显微镜软件中输入以下扫描参数：12 位强度分辨率、500 赫兹扫描速度，帧均值为 2，放大倍数为 2.2。通过选择 1024 × 1024 的扫描分辨率，在显微镜软件中设置以获得最佳的横向分辨率。

通过选择一个空气单位的共聚焦孔径和210纳米的Z步长，优化轴向分辨率和光学切片效果。分别扫描每个信号，并调节探测器电压和偏移，以消除任何过饱和和欠饱和像素。启动神经信号的实时扫描，调节Z轴焦点控制，在显微镜软件中确定并设定包含组织切片内神经信号的上下焦平面。

使用连续扫描方式扫描最终的Z系列图像，以消除荧光信号串扰。在原始图像的复制图像上，使用选择工具围绕表皮绘制区域，从而将表皮从角质层和真皮中分离出来，然后将图像裁剪至所选区域。

使用计算扩散函数功能，为绿色和红色荧光共聚焦信号计算点扩散函数。然后设置介质折射率，油的折射率为1.515，40倍油镜的数值孔径为1.25。将探测器针孔设为1个空气单位，并选择激光激发波长。

使用迭代恢复，置信度设置为100%，迭代次数上限为10个循环，并分别采用绿色和红色的点扩散函数（PSF）对绿色和红色荧光信号进行去卷积。使用“创建表面”工具，在去卷积后的神经信号周围生成表面，选择取消勾选平滑特征，采用绝对强度进行阈值分割，下限阈值设为3,000，上限阈值设为65,535。保留大于10个体素的表面。

使用神经表面的编辑选项卡，选择单个非神经表面，或按住 Control 键选择多个非神经表面，以去除非神经表面。按下 Delete 按钮删除所选的非神经表面。在神经表面中使用编辑选项卡，并在掩膜属性中按下“全部掩膜”按钮。

在新窗口中，于通道选择下选择第五通道经去卷积处理的线粒体信号，然后在应用掩膜前勾选“复制通道”选项。按下“内部/外部恒定”单选按钮，并勾选“将表面外部的体素设置为 0.0”，然后点击“确定”按钮。最后，使用“创建表面”工具生成线粒体特异性表面：通过选择取消勾选“平滑特征”选项，并采用背景减除法进行阈值设定，以在已掩膜的去卷积线粒体信号周围生成表面。

将最大球体的直径设置为 1.50 微米，下限阈值设置为 2,000，上限阈值设置为最大值 65,535。确保表面大于 1.0 个体素。此代表性三维共聚焦显微镜图像展示了神经特异性的绿色荧光信号。

神经信号会生成一个以青色显示的三维表面。然后，利用该神经表面作为掩模工具，将神经特异性的线粒体信号从表皮中其他线粒体信号中分离出来。所获得的神经特异性线粒体红色荧光信号用于在线粒体内生成以品红色显示的表面，该表面位于以青色显示的神经表面范围内。

这使得神经纤维中的线粒体能够被清晰观察。此处，线粒体表面积数据以大小频率直方图形式呈现，用以可视化不同体积范围内线粒体所占的百分比。在进行该操作时，需注意在染色过程中保护组织，确保组织完全浸没在溶液中，以实现切片内染色的均匀性和一致性。

观看本视频后，您应能够充分理解如何对人类表皮内神经纤维中的线粒体进行可视化和定量分析。我们提供的详细实验方案旨在指导其他研究人员如何对人类皮肤活检样本进行染色、成像、图像处理和分析，以期深入理解线粒体相关神经系统疾病（如神经病变）发病机制的潜在机理。