细菌表面运动性实验的制备、成像与定量分析

本实验的总体目标是以标准化且可重复的方式观察并量化一种称为群集运动的细菌表面运动行为。该目标通过以下步骤实现：首先制备并固化表面运动平板，第二步是将细菌接种至表面运动测定平板，并在受控环境中进行培养。

接下来，实时成像平板实验中细菌的生长模式。该实验的最后一步是对图像进行处理以实现定量分析。最终，本实验流程为表面运动性平板实验的制备提供了标准化方案，可获取诸如 swarm 扩展速率或表面模式细菌的生物产物密度分布等定量动态信息。

许多研究团队会进行表面运动性实验。该技术的主要优势在于，我们提供了一套系统化的实验方案，可最大限度减少可能导致结果不一致的多种变量。该方法有助于回答细菌表面运动性研究领域中的关键问题，例如细菌如何在不同类型的表面上定植。

尽管此方法经适当修改后可为假单胞菌的群集运动研究提供见解，但也适用于研究其他表面运动型细菌。通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为实验方案或实验室环境的微小变化都可能显著影响群集实验的结果。本实验操作将由我实验室的研究生 Morgan 演示。

开始实验方案时，准备一种凝胶混合物：将 200 毫升不含硫酸铵的 FAB 群游培养基、0.9 克贵重琼脂和 0.2 克氨基酸加入一个 500 毫升的培养基瓶中。使用磁力搅拌器彻底混匀培养基。接着，在高压灭菌器中以 121.1 °C 加热灭菌 22 分钟，并选择快速排气模式。

灭菌后立即拧紧培养基瓶盖，以防止水分蒸发。将培养基置于磁力搅拌器上，在室温环境下持续搅拌，使AED冷却至50摄氏度。若需在后续实验时间点使用该琼脂培养基，可在60摄氏度水浴或培养箱中保温最多15小时，期间无需持续搅拌。

当培养基温度降至约 50 摄氏度时，加入两毫升过滤除菌的葡萄糖，使用标准无菌技术，用磁力搅拌子充分混匀，以防止培养基中产生气泡。在超净台内，使用无菌刻度移液管将 7.5 毫升培养基分装至各个 60 毫米的培养皿中。若需要更大的群游表面面积，可将 25 毫升培养基分装至 100 毫米的培养皿中。

将所有培养皿分开放置，不要叠放，并使用水平仪检查通风橱，确保琼脂凝固的表面水平均匀。对于60毫米的培养皿，将皿盖移开，将未加盖的琼脂在通风橱中静置固化30分钟。较大的100毫米培养皿则需要更长的固化时间。

特定实验室的湿度、气流和温度可能需要测试您所研究细菌产生最佳群集运动所需的干燥时间。干燥后，应立即将预先在其他培养基中培养至所需生长阶段的细胞接种到APLs上。首先，从新鲜的LB平板上挑取一个孤立的细菌菌落，并接种至六毫升培养基中。

将培养物在37摄氏度下水平振荡培养过夜。次日，用无菌牙签或金属接种针根据细菌菌株的不同，取一至五微升过夜培养物接种于干燥的群游琼脂平板表面。将群游实验平板转移至温度设定为30摄氏度、37摄氏度或42摄氏度的培养箱中，并将平板倒置，使多余水分凝结在皿盖上而非琼脂表面。在开始延时成像前，于对应菌株的特定温度下平衡两小时或四小时。

接下来，将平板转移至活体成像仪中，使琼脂表面的细菌朝下，面向仪器的倒置相机。在所有培养皿盖内加入少量水，然后将每个皿盖内水面朝上，放置于倒置的AER平板上方。

在成像单元内，密封成像腔以维持恒定的湿度水平，调整成像单元的成像参数，并开始对群集运动进行延时成像。实时成像结束后，可在表面运动实验中使用标准图像分析软件（如 Image J）分析细菌的群集动态。在接种前检测琼脂的水分含量，对于获得成功的群集实验结果至关重要。

优化的AER平板将有助于形成紧密的接种点并增强细菌的群集运动活性，而过度干燥的平板则会抑制表面运动。除了水分含量外，培养基中添加物的有无也会根据培养温度影响细菌的群集活性，特别是利用表达发光或荧光蛋白的菌株时。两种不同细菌物种之间的群集竞争动态可通过延时视频进行记录。此外，通过延时荧光显微镜还可确定并定量分析细菌群集中局部细胞密度的变化以及促进运动性脂质的生物合成速率。

遵循本实验方案后，还可采用其他方法，如共聚焦显微镜，以探究单个细胞的行为，从而对细菌表面运动性进行详细、微观层面的分析。观看本视频后，您应能够充分掌握如何开展标准且可重复的群集运动实验，并通过制备、固化及接种表面运动性实验平板，以及处理和分析细菌生长模式的结果，全面解析细菌的表面运动行为。