构建无功能突变体以阐明细菌糖基转移酶在细菌运动性中的作用

因此，神经氨酸衍生物仅存在于致病性细菌中，而氨基糖基化的鞭毛含有这种糖。通过对基因中包含区域进行框内缺失，有助于发现鞭毛糖基化相关基因簇。该技术可用于特异性缺失最新发现的特定区域或基因，例如在不同生物学过程中发挥作用且彼此间具有高度同源性的糖基转移酶基因，进而分析其在鞭毛糖基化过程中的作用。

该技术还有助于研究糖基转移酶在致病菌相关多糖生物合成中的作用，以及编码鞭毛形成相关蛋白的基因的功能。本实验操作将由本实验室技术员 Maite Polo 演示。设计两对引物，分别扩增待删除基因或区域上下游的 DNA 片段。

引物A和D需要在5'端包含一个限制性内切酶的酶切位点，该酶切位点可用于在pDM4载体中进行克隆。引物B和C必须位于待删除的基因内部，或位于待删除区域的第一个和最后一个基因内部。确保这两个引物处于正确的阅读框内，并且位于基因内部5到6个密码子之间。

确保两个引物的5'端均包含21个碱基对的互补序列，以连接DNA扩增子AB和CD。以100纳克纯化的染色体DNA为模板，分别使用AB和CD引物进行两组不对称PCR，随后在1%琼脂糖凝胶中分析扩增产物。从电泳凝胶中切下扩增子并进行纯化和定量。将每种扩增子各100纳克与不含引物的PCR试剂混合。

延伸后，加入A和D引物，并将其扩增为单一片段。随后按照先前所述方法对产物进行分析、纯化和定量。用一种内切酶分别消化1 µg的pDM4质粒和400 ng的AD扩增产物。

将消化后的 pDM4 与 AD 扩增片段按 1:4 的摩尔比（载体:插入片段）混合，配制连接反应体系。在 20 摄氏度下孵育过夜。随后，在 70 摄氏度下孵育 20 分钟以灭活 T4 连接酶。

将大肠杆菌菌株接种于LB肉汤培养基中，在30摄氏度、200转/分钟振荡条件下培养，直至观察到光密度值在0.4至0.6之间。在4摄氏度、5,000 ×g 条件下离心15分钟，收集菌体沉淀。用预冷的蒸馏水重悬菌体沉淀，并重复洗涤过程两次。

将细菌悬液转移至微量离心管中，在14,000 × g、4 °C条件下再次离心5分钟。用预冷的水重悬沉淀后，加入约3.5 µL连接反应混合物，冰上孵育5分钟。将混合物转移至预冷的2 mm间隙电穿孔比色皿中。

电穿孔后加入SOC培养基，并将内容物转移至培养管中。在30°C、200 RPM振荡条件下孵育1小时。将转化后的细胞涂布于添加氯霉素的LB琼脂平板上。

使用跨越 pDM4 克隆位点的引物，通过 PCR 检测缺失构建体是否插入 pDM4 中。准备过夜培养物，包括利福平抗性的受体气单胞菌株以及两种不同大肠杆菌菌株：携带 pDM4 重组质粒的供体菌株和携带 PRK2073 质粒的辅助菌株，均在 30 摄氏度下培养。

将相同数量的供体、受体和辅助菌株分别悬浮于三支含有150微升LB培养基的LB试管中。然后，在不含抗生素的LB琼脂平板上，将三种细菌悬浮液按受体∶辅助∶供体为5∶1∶1的比例各取两滴混合，并于30摄氏度倒置培养过夜。通过向LB琼脂平板中加入1毫升LB液体培养基收集细菌。将菌液转移至1.5毫升锥形微量离心管中，剧烈涡旋振荡。

在含有利福平和氯霉素的LB琼脂平板上涂布100微升细菌悬液。将200微升和600微升的样品离心沉淀，将沉淀物重悬于100微升LB液体培养基中，接种至含利福平和氯霉素的LB琼脂平板，随后进行培养。进行氧化酶试验以确认菌落为气单胞菌。

使用引物 E 和 F 通过 PCR 进一步确认 pDM4 重组质粒插入到染色体特定位点。将重组菌落接种于 2 毫升 LB 培养基中，添加 10% 蔗糖且不加抗生素，于 30 摄氏度过夜培养。制备不同浓度的菌液稀释液后，取 100 微升细菌培养物及其稀释液涂布于含 10% 蔗糖的 LB 琼脂平板，于 30 摄氏度过夜培养。

第二天，挑取菌落并将其转移至含有氯霉素和不含氯霉素的LB平板上。在30摄氏度下过夜培养后，挑选对氯霉素敏感的菌落。使用EF引物对敏感菌落进行PCR分析，并选择PCR产物大小与缺失构建体预期大小相符的菌落。

在盖玻片的四个角各放置一滴硅酮，将过夜培养的气单胞菌（Aeromonas）培养物固定于盖玻片上。将凹玻片置于盖玻片上，然后将整个装置倒置。使用光学显微镜通过明场显微镜观察分析细菌的游动能力，随后取三微升（3 µL）培养物接种至软琼脂平板中央。

将平板在25至30摄氏度下正面向上孵育过夜。孵育结束后，使用直尺测量细菌从平板中心向琼脂边缘迁移的距离。在25至30摄氏度下，将气单胞菌菌株在900毫升TSB培养基中过夜培养。

离心后，将沉淀重悬于 20 毫升 pH 7.8 的 100 毫摩尔 Tris 盐酸缓冲液中。为去除锚定的鞭毛，将悬液中加入玻璃棒在涡旋振荡器上剧烈震荡 3 至 4 分钟，然后反复通过 21 号针头抽吸。在 4 °C 下连续进行两次离心以沉淀细菌，并将上清液收集至另一离心管中。

超速离心上清液后，将沉淀重悬于150微升含有2毫摩尔EDTA缓冲液的100毫摩尔Tris盐酸溶液中。取150微升鞭毛富集组分转移至薄壁超清晰管中，并加入12毫升氯化铯溶液至满。在4摄氏度条件下，使用摆桶转子以60,000 × g离心48小时。

用注射器收集鞭毛条带，将其加入氯化铯梯度中，并用100毫摩尔/升Tris盐酸缓冲液（含2毫摩尔/升EDTA）透析，随后通过电泳及考马斯亮蓝染色或质谱分析进行检测。在下图中，WT泳道为鱼类气单胞菌AH3，泳道1至8显示第二次重组的氯霉素敏感菌落。

ST 是超膀胱 1KB 标记物。第 1 至第 3 泳道以及第 5 至第 8 泳道显示含有野生型 FGI4 基因的菌落，对应泳道标记为 WT。第 4 泳道显示含有 FGI4 基因缺失的菌落。光学显微镜检测表明，极生或侧生鞭毛的修饰仅导致迁移直径减小，因此 AH-3 FGI 突变株和 AH-3 FGI-4 突变株相较于野生型菌株仅表现出运动能力下降。

图中显示了泳道一AH-3的极生鞭毛，以及泳道二FGI区域和泳道三FGI-4基因的无突变株，其中这两个突变株的极生鞭毛蛋白分子量均低于野生型菌株，提示鞭毛糖链结构发生了改变。必须确保突变不会影响下游基因，导致鞭毛无法组装或鞭毛丝状结构无法形成。当鞭毛蛋白的变化不可检测时，需对鞭毛蛋白肽段的总蛋白进行质谱分析，以确定糖链的质量。