应用自动化图像引导膜片钳技术研究脑片中的神经元

该技术的总体目标是利用计算机视觉自动检测急性脑切片中的荧光标记细胞，并对这些细胞进行自动膜片钳操作。该方法有助于克服膜片钳电生理学领域中的关键难题，例如荧光标记细胞的识别、靶向定位和膜片钳操作。该技术的主要优势在于能够自动识别膜片钳移液管和荧光细胞，并将这些步骤与自动膜片钳操作整合在一起。

这项创新显著提高了实验通量。该技术的应用前景涵盖神经系统疾病的治疗或诊断，因为高通量成像引导的自动膜片钳技术可用于更接近生理状态的神经元样本中的药理学筛选。该方法还可应用于其他体外样本，如神经元细胞器典型样本、脑片培养、分离的神经元，以及任何非神经元细胞。

开始此操作时，先打开放大器、显微镜控制器和操纵器控制器。然后，通过命令行终端使用 Python 运行 Autopatcher IG，首先切换到安装 Autopatcher IG 的目录，接着输入命令 Python Autopatcher_IG。

在命令行终端中输入 PYW，然后按回车键。之后，用内部溶液充满所有玻璃移液管，并将其装载到显微操作臂上。将移液管尖端移至显微镜视野内，并调至清晰对焦。

如果使用拨号盘移动显微镜载物台上的操纵器，请按键盘上的 Z 键更新坐标。主校准将操纵器移动的角度和距离转换为显微镜坐标系。操纵器沿三个方向以预设距离移动，软件则检测显微镜视野内移液管尖端的坐标。

在主图形用户界面（GUI）上，点击与装有移液器的单元相对应的“开始校准”按钮。随后，点击主图形用户界面底部的“保存校准”以保存校准结果。除非设备的物理结构发生改变，否则该初始校准仅需执行一次。

在此步骤中，将一片脑切片置于记录室中央。使用切片固定装置或网格固定器稳定脑切片。为检测荧光细胞，在四倍放大倍数下找到感兴趣的区域。

然后，开启点击移动模式，点击目标区域的中心，以移动显微镜载物台。或者，也可使用键盘上的数字键来移动显微镜载物台。接下来，切换至高倍物镜，并通过键盘上的RF键调节显微镜在Z轴方向的焦距。

软件控制显微镜和相机在不同深度拍摄一系列图像。随后，这些图像经过计算机视觉处理，以识别荧光标记的细胞。最终输出结果为检测到的细胞坐标的列表。

单击主图形用户界面（GUI）第一列第零单元的“检测细胞”按钮。如果实验装置的LED或激光光源无法通过TTL信号控制，请手动打开LED或激光。必要时关闭LED或激光。

细胞坐标列表将显示在内存位置图形用户界面中。通过点击坐标旁的 X 按钮，从列表中移除不需要的细胞。或者，如果目标细胞未进行荧光标记，可在主图形用户界面中点击鼠标模式。

然后，单击目标细胞，细胞上将出现一个带数字的黄色圆点，同时该细胞的坐标将显示在内存位置图形用户界面中。为了检测移液管偏移坐标而进行二次校准，需用内部溶液填充玻璃移液管的三分之一。随后，将移液管安装到连接在显微操作仪上的移液管支架中。

在低倍镜下，使用小键盘上的数字1和2在单元一与单元二之间切换。然后，将移液器移入视野，并使用小键盘调节焦距。接下来，单击“加载校准”以加载初始校准参数。

将显微镜物镜切换至高倍镜，并在主图形用户界面中点击40次。将移液器吸头移至中心位置，然后点击主图形用户界面上正在使用的单位下方的二次校准按钮。

要对目标细胞进行膜片钳记录，首先点击膜片钳控制按钮以打开膜片钳控制图形用户界面。然后在记忆位置图形用户界面的坐标列表中，点击目标细胞旁边的“前往”按钮。随后，点击主图形用户界面中该单元的CTM按钮，以启用移动功能。

单击目标细胞，将移液管尖端移至该细胞。由于操作器存在机械限制，在移动距离超过500微米时，可能会出现轻微的位置偏差。为避免较大的机械定位误差，应在目标细胞附近进行二次校准。

接下来，使用“选择单元”按钮在两个单元之间切换输入信号。单击补丁控制图形用户界面（GUI）上的“补丁”按钮。自动封接将开始，可在补丁控制图形用户界面（GUI）上监测压力和电阻。

自动封接算法通过一系列逻辑循环监测电阻并控制压力，以形成吉欧封接。弹出窗口会提示吉欧封接的形成。系统利用电阻变化来识别细胞表面接触。

如果未能及时检测到细胞表面接触，请使用下一个按钮在同一次自动封接尝试中推进至封接阶段。通过点击补丁控制图形用户界面（GUI）上的相应按钮，可在任意时刻操控自动过程。然后选择“是”以结合电击和抽吸进行穿孔。

或者选择“否”，仅通过吸力进行穿孔。然后保存实验膜片记录日志。此图显示了已加载到命令序列图形用户界面中的选定位置。

左侧列显示坐标列表，右侧列以TTL信号形式显示每个位置对应的指令列表。以下是药物应用实验期间的截图，对应于所选的三个位置。KCl溶液中加入了红色荧光染料，以便于可视化。

单元一为含KCl的移液管，单元二为膜片钳移液管。本图中，阶梯电流注入显示了一个规律性放电的神经元。此处展示的是在三个位置局部施加500毫摩尔氯化钾溶液后的电压钳制记录轨迹。

红色迹线显示的是氯化钾溶液接近膜片细胞时记录到的内向电流。红色箭头指示氯化钾施加的时间点。采用该方法，可在四分钟内完成一次膜片钳实验，相比传统人工膜片钳技术，无需 extensive training。

在完成该操作步骤后，可进一步开展光遗传学、化学遗传学以及药理学干预等其他方法，以回答与您的研究项目相关的问题。该技术在建立之后，有望为神经科学领域的研究人员探索不同体外制备模型中突触受体和离子通道的高通量研究提供新的途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何开展图像引导的自动化膜片钳实验。