关联星形胶质细胞 KCNJ10（Kir4.1）基因特异性 DNA 甲基化变化与其表达及转录活性

本实验的总体目标是评估富集的星形胶质细胞群体中 KCNJ10 的 DNA 甲基化状态，并将启动子区域的 DNA 甲基化变化与转录活性变化相关联。该目标通过以下步骤实现：首先利用流式细胞分选技术从整个啮齿类动物脑组织中分离出富集的皮层星形胶质细胞群体，随后从该富集的星形胶质细胞群体中提取 DNA。然后采用甲基化敏感性高分辨率熔解分析（MS.HRMA）来评估 KCNJ10 的 DNA 甲基化状态。

最后，KCNJ10 启动子呈现高甲基化状态，通过荧光素酶报告基因检测（luciferase assay）来分析启动子区 DNA 甲基化水平的变化与转录活性之间的相关性。最终，采用 MS-HRMA 和荧光素酶报告基因检测来测定 KCNJ10 的 DNA 甲基化状态，并分析启动子甲基化水平变化与基因转录活性之间的关联。本实验操作流程将由我实验室的一名博士后研究员进行演示。所有动物实验均严格按照美国国立卫生研究院（NIH）实验动物管理与使用指南进行，并经阿拉巴马大学伯明翰分校动物护理与使用委员会批准。

所有缓冲液和试剂均按照文字方案进行配制。根据文字方案，从安乐死动物的头部解剖出大脑皮层后，在50毫升离心管顶部切割或使用磨具钻一个孔，以便将导管插入管内，然后向管中加入木瓜蛋白酶溶液。

将解剖得到的皮层组织置于含有已平衡至95% O2与5% CO2的解离培养基的10毫米培养皿中，使用洁净的剃刀将组织切成1毫米×1毫米大小的碎块。用10毫升移液器将组织转移至含有pepase溶液的50毫升离心管中。在排出液体前，让组织在移液器内沉降至管底。

为尽量减少解离介质的残留量，同时避免胰蛋白酶溶液产生气泡，在37摄氏度水浴中孵育20分钟期间，通过表面气体交换持续通入95% O₂与5% CO₂的混合气体。孵育结束后，使用10毫升移液管缓慢吹打组织10次，随后将浑浊的细胞悬液在室温下以300 G离心5分钟。通过表面气体交换平衡DNA酶-白蛋白抑制剂溶液，并将沉淀的细胞重悬于3毫升该溶液中。

然后按照生产商说明书制备商用非连续密度梯度。以70 G离心6分钟。随后使用移液器吸取管底的解离细胞，去除培养基。

使用2至3毫升含0.02%牛血清白蛋白及每毫升1毫克DNA或选用的培养基。为重复使用，悬浮解离后的细胞。在按照文本方案进行流式分选以及DNA或RNA提取前，需将细胞通过40微米滤膜过滤。

针对亚硫酸氢盐转化的DNA序列设计引物后，按照文本方案进行DNA扩增：使用优选的DNA聚合酶和5微摩尔引物，对每个样本的500至1000纳克DNA以及来自相同动物物种、甲基化程度从0%到100%的甲基化DNA标准品进行亚硫酸氢盐转化。设置20微升反应体系用于Ms-HRM扩增。根据此表格，将所有样本（包括样本DNA和甲基化标准品）每个设置三个复孔进行运行，具体参数依据分析软件的要求设定，并在熔解曲线相变区域前后设置起始和终止参数。

设定预熔解起始和预熔解终止参数，两者之间的温差为0.2至0.5摄氏度。以类似方式设定熔解后起始和终止参数，并利用不同甲基化百分比的标准品及其对应的峰值温度差，提取每个样本的峰值温度差数据。

生成线性回归方程。在确定感兴趣的CpG岛并根据文本方案扩增和克隆CpG岛Luke两个质粒后，使用该线性回归方程估算未知样本的甲基化状态。使用首选的限制性内切酶分析软件验证限制性消化位点，以避免双重切割，并在样本经适当酶消化后，将30微克质粒线性化。

在50 µL反应体系中，于适当温度和时间内进行酶的热失活。使用5个单位的CPG甲基转移酶，在30°C条件下对700 µg线性化质粒进行甲基化，反应时间为13至19小时。

按照文本方案中所述清洗DNA后，取1微克甲基化DNA样品，加入HPA两种限制性内切酶，在37摄氏度下孵育1小时，进行双酶切反应。将酶切后的DNA样品在1%琼脂糖凝胶中以100伏电压电泳45分钟，以便观察。接下来，将甲基化和非甲基化的质粒分别与相应的限制性内切酶在适宜条件下共同孵育过夜，进行双酶切，以释放全长的Luke2载体和CPG岛片段。

消化完成后，对酶进行热灭活。将双酶切的样品在1%的琼脂糖凝胶中以100伏电压电泳运行一小时，以分离载体和插入片段；然后在佩戴防紫外线防护装备的情况下，将凝胶置于紫外灯下，使用洁净的手术刀切下甲基化和非甲基化的插入片段。根据文本方案进行DNA胶回收后，使用T4 DNA连接酶，按载体与插入片段1:4的比例，将甲基化和非甲基化的插入片段连接至非甲基化载体中。连接反应后，在-20°C或冰上孵育过夜。

用1% DNA琼脂糖凝胶电泳检测样品，纯化DNA并验证重新连接效果，评估重新连接的质粒浓度。在12孔板中接种CD54细胞，每孔140,000个细胞。24小时后，使用商用转染试剂，将等浓度的非甲基化CPG环状质粒加RAN vanilla或其它对照载体，或甲基化cpg Luke 2质粒加ELLA或其它对照荧光素酶载体转染细胞。转染24小时后，进行荧光素酶检测。

根据制造商的说明，使用光度计对每个孔进行三次重复读数。计算萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶或其他对照的比值。荧光素酶活性。

通过将甲基化的荧光素酶活性除以非甲基化的荧光素酶活性，对甲基化的海肾荧光素酶对照活性进行归一化处理。如本实验所示，通过流式分选E-G-F-P-S 100β转基因动物，获得了富集的星形胶质细胞群体。根据前向散射和侧向散射设定门控，利用溴化物死细胞指示剂确定活细胞群体；此处所示门控图像为解离后、分选前及分选后的EGFP阳性星形胶质细胞代表性图像。该图显示了一个分离出的EGFP阳性细胞群体，其星形胶质细胞特异性标志物的mRNA水平增加了40倍。

LDH 一 L 一。此外，尽管 OPC 细胞和星形胶质细胞共同表达 S100β 和 NG2，但观察到 NG2 mRNA（少突胶质前体细胞的标志物）减少了四倍，表明已成功分离出富集的星形胶质细胞群体。本表格列出了从不同年龄和数量的动物中分离得到的总 RNA 和 DNA，可作为参考，用于评估后续实验中分子产物的预期得率。

最后，通过将甲基化插入片段转移至非甲基化载体后，采用双荧光素酶报告基因检测来评估目的基因甲基化区域的转录活性。使用仅切割非甲基化DNA的HPAⅡ酶来验证质粒的甲基化状态。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用FACS分离富集的星形胶质细胞群体，以及如何检测基因的DNA甲基化水平，并通过甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析和荧光素酶报告基因检测，分别将启动子区DNA甲基化的改变与转录活性相关联。