高通量技术的应用 体外 用于构建口腔多物种生物膜的微流控系统

本实验的总体目标是构建具有代表性组成的多物种牙菌斑生物膜。为实现这一目标并进行平行分析，首先需要制备具有代表性的培养基和接种物。接种物经前夜培养后被引入微流控芯片，生物膜随即在微通道内形成。

最后，对生物膜进行洗涤并染色，用于原位共聚焦激光扫描显微镜或落射荧光显微镜观察。该技术相较于现有方法（如流动池系统）的主要优势在于，它是一个高通量系统，能够在使用较少材料且无需人工实验室培养基的条件下，平行开展多个实验。首先，从五名或更多志愿者组成的队列中，分别在单独的50毫升塑料管中收集唾液样本。

将唾液样本吸入一个置于冰上的塑料烧杯中。此操作中应避免使用玻璃烧杯，因为唾液生物聚合物容易吸附在玻璃表面。接着，向样本中加入二硫苏糖醇，直至其终浓度为 2.5 毫摩尔。

将混合物在冰上搅拌10分钟。将所有内容物转移至多个塑料管中。在4 °C预冷的离心机中高速离心30分钟，以分离样品中的颗粒物质。

将唾液样本转移至新的无菌容器中，并弃去沉淀组分，以从样品中制备无菌培养基。首先，用三倍体积的去离子水稀释去除了食物残渣的样品。然后使用0.22 µm低蛋白结合膜滤器过滤。

在保持滤后组分冰上冷藏的同时对唾液进行灭菌。将灭菌后的溶液分装，并于-80摄氏度保存备用。从包含五名或更多志愿者的队列中采集唾液样本，置于无菌的50毫升塑料管中。

将唾液样本吸入一个室温下预先灭菌的塑料烧杯或50毫升离心管中。加入灭菌的甘油，直至形成25%甘油和75%唾液的混合液。

与使用过滤步骤去除污染物的培养基方案不同，此处无菌操作技术至关重要，以防止非口腔特异性细菌或真菌污染。混合唾液甘油溶液，将唾液甘油混合物分装至各孔中，并将样品保存在零下80摄氏度，直至需要时使用。

在室温下将样品接种至微流控芯片之前，购买或制备具有类似此处所示微通道的微流控芯片，用于细菌阴性培养基和细菌阳性接种物。在进行主实验前，先将每根试管涡旋振荡五秒钟以混匀，然后从向微芯片的出口储液池中加入100 µL培养基开始。使用计算机控制的泵启动培养基在微通道中的剪切流动，持续两分钟。

在室温下，目视检查每个通道，确保液体填充充分。将微芯片在室温下孵育20分钟。此步骤可在微通道侧壁上形成生物聚合物支架，生物膜在生长过程中将锚定于该支架上。

然后手动吸出或从出口储液池中移除剩余的培养基，并将此部分转移至入口储液池，作为流体动力平衡负载。在生物聚合物支架沉积完成后，向出口储液池中加入100 µL细菌阳性接种液。将微流控芯片置于37 °C加热板上，并启动中等剪切力的反向流动。

从出口流向入口储液池，精确持续六秒。然后关闭泵，在37摄氏度下将芯片静置孵育40分钟，以促进细菌或真菌附着于微通道侧壁。接下来，用移液器移除并弃去出口储液池中的全部接种液，再向该储液池中加入一毫升无菌培养基，重新填满储液池。

将微芯片置于37摄氏度下，在低剪切流条件下孵育约20小时，以促进过夜培养期间微通道内的生物膜生长。用移液器吸出入口和出口储液池中的所有溶液。在入口储液池中加入100微升磷酸盐缓冲液（PBS），冲洗微通道20分钟。

在从入口到出口的低剪切正向流动条件下，生物膜现已准备好进行活/死染色。在对生物膜染色前，根据文本方案中所述，为每个待染色的通道配制 100 微升的活力染色混合液。将该溶液避光保存，直至使用时取出。用移液器吸尽入口处残留的所有液体，并向同一储液池中重新加入 100 微升活力染色混合液。

然后将染色液以45分钟的时间推过微通道。在室温下低剪切流条件下，注意避免芯片暴露于光线下。用移液器吸尽进样储液池中所有残留液体，并重新加入100微升PBS。

在室温下以低剪切流冲洗微通道 20 分钟，以去除未结合的过量染料。染色后的生物膜现已准备好进行荧光显微镜检测，以分析其三维结构。通过共聚焦显微镜进行水平扫描并构建数字重建图像，可从任意倾斜角度观察生物膜的整体结构。

此外，可对同一数据集进行活/死染色分析，以研究不同化学处理条件下生物膜内细胞活力的空间依赖性。生物膜成像后，可从未染色通道中提取细胞。利用蒸馏水在高剪切流条件下冲洗，随后可通过454焦磷酸测序技术从基因组DNA中鉴定生物膜菌群组成。

按照此操作步骤，还可采用添加不同物种或化合物等其他方法，以回答不同的科学问题，例如在不同条件下多物种生物膜会发生何种变化。