可视化 肺炎链球菌 心脏微损伤及其后续心脏重塑

以下实验的总体目标是展示一种可在感染小鼠心脏内重现的 ESMO 心脏微小病灶形成方案。该方法通过用 ESMO 感染小鼠并使其发展为菌血症，从而使细菌进入心脏血管系统，侵入心肌并形成显微病灶。随后，将心脏组织或包埋于石蜡中进行常规染色，或固定于 OCT 包埋剂中以进行免疫荧光染色。

对染色切片的评估可显示心肌中随机分布的心脏微小病变、胶原沉积以及恢复期心肌切片中的肺炎链球菌荚膜，从而证实该实验方法。Armand Brown 是我实验室的研究生吗？尽管该方法可用于研究小鼠侵袭性肺炎链球菌病期间肺炎链球菌对心脏的损伤作用。

该方法也可应用于来自其他系统的心脏样本，例如非人灵长类动物或人类。首先在Todd Hewitt肉汤中培养ESMO第四血清型Tiger 4菌株，使其在620纳米处的光密度达到0.5。当菌液达到正确密度后，在3,500 G下离心10分钟以收集菌体沉淀。

然后使用真空管线去除上清液，并用无菌 PBS 将细菌重悬至每毫升含 10,000 个菌落形成单位。对 10 至 12 周龄的 valve C 小鼠进行麻醉，并用钝头镊子轻轻夹捏脚趾以确认其麻醉状态，用含有细菌悬液的注射器吸取悬液，并安装 27 至 30 号针头。然后用一只手抓住麻醉小鼠的颈部皮肤，另一只手将其腹腔注射 100 微升悬液，之后将每只小鼠放回其笼中。

小鼠通常在注射后30至40秒内苏醒。肺炎链球菌（S pneumoniae）的剂量必须准确，否则小鼠可能从感染中恢复，或过快发展为侵袭性肺炎球菌疾病，导致病灶无法形成。由于每种细菌菌株的耳部致病性不同，可能需要通过反复试验来确定合适的剂量。

让感染持续至少24小时以进入早期阶段，或持续至30小时以进入晚期感染阶段。随后对每只感染小鼠实施安乐死。首先采集血样，用酒精棉片消毒尾部，剪去2至3毫米的尾段。

从切口处采集两微升血液。用含有肝素钠（每毫升含一个单位）的磷酸盐缓冲液将血液进行十倍系列稀释。将五个稀释梯度的样品接种于三联苯丙氨酸大豆血琼脂平板上，并过夜培养。

第二天进行菌落计数。按照下一节所述方法继续进行心脏收获。或者，在感染后30小时进行。

通过腹腔注射100微升生理盐水中含有氨苄青霉素的方法尝试抢救小鼠。每12小时持续给予氨苄青霉素，共36小时，并在预定的时间点采集心脏。首先，收获心脏。

将安乐死的小鼠仰卧位固定于手术台上，用70%乙醇喷洒胸部并轻轻擦干。使用手术剪和镊子打开胸腔，移除肋骨 cage，并横断膈肌以暴露心脏和肺脏。

然后剪断与心脏相连的血管，用镊子轻轻摘除心脏，避免造成挫伤。用PBS冲洗心脏，并将其放入组织标本收集盒中，以备进行冠状切片。随后将标本盒转移至10%缓冲福尔马林溶液中，次日送检进行石蜡包埋。

在早期阶段，心脏病变可通过其颜色外观的改变，以及在某些情况下免疫细胞的存在来识别。在晚期病变中，免疫细胞将消失，并被较大的类似血管瘤的病变所取代。

使用带正电荷的玻璃载玻片上的5微米心脏切片，首先将切片冷冻，然后解冻并使其风干。在25摄氏度下用10%中性缓冲福尔马林固定10分钟。随后用PBS洗涤三次，每次五分钟，以去除固定剂。

用含0.2% Triton X-100的PBS溶液透化组织，持续15分钟。用PBS缓冲液再清洗三次，每次均彻底去除去污剂。随后，在PBS中漂洗后，用含10%正常血清的PBS溶液于室温封闭组织1小时，然后加入一抗溶液，37摄氏度孵育2小时。

使用未免疫的兔抗血清处理阴性对照。由于心肌组织容易非特异性吸附XI免疫荧光染料，导致背景信号较高，因此针对不同类型的抗体，其孵育浓度和时间可能需要优化。两小时后，用PBS洗去抗血清，然后更换为二抗溶液，将载玻片在37°C下孵育30分钟。随后加入DPI（5毫克/毫升），再用PBS洗涤载玻片。

最后，用封片剂封片，保存并使用共聚焦显微镜进行成像。首先去除石蜡，并对组织切片进行水化处理。依次使用二甲苯清洗，然后用梯度酒精溶液清洗。

然后将切片浸入0.2%磷酸溶液中5分钟，接着用清水冲洗5分钟；随后用0.1%猩红红和鞣酸染色2小时。接着将切片在0.01 N盐酸中洗涤3分钟，并用70%乙醇冲洗1分钟。随后通过逆向梯度酒精系列进行脱水，再用二甲苯洗涤，最后用光学显微镜封片并评估玻片。

小鼠在受到Tiger菌株攻击后发展为侵袭性肺炎球菌病。在心室中观察到四型菌株引起的心脏微小病变，且在感染后24至30小时之间，病变的大小和数量均有所增加。为确认肺炎链球菌确实存在于病变部位，对组织切片进行了染色，以检测Tiger四型菌株产生的四型荚膜多糖。

这证实了微损伤部位内存在紧密堆积且致密的聚集体。对经氨苄青霉素救治的小鼠及未感染对照组小鼠的心脏切片进行了匹罗红染色。在救治组中。

在脑室中原本似乎是病灶部位的位置，染色的范围和强度均出现显著增加，并伴有条带状扩散。在进行该操作时，需注意使用足量的肺炎链球菌感染小鼠，以确保感染持续至少28至30小时，从而使菌血症和心脏微小病灶有足够时间形成。