用于多模态分子成像应用的生物功能化普鲁士蓝纳米颗粒

本实验的总体目标是合成可用于多模态分子成像剂的生物功能化普鲁士蓝纳米颗粒。首先合成含有钆或锰离子的普鲁士蓝纳米颗粒，以增强磁共振成像（MRI）信号；第二步是在纳米颗粒表面连接荧光素标记的亲和素（fluorescent avadon），从而赋予其荧光成像能力。

接下来，将包被阿瓦单抗的纳米颗粒与所需的细胞靶向生物素化抗体进行生物功能化修饰。最后一步是对生物功能化修饰后的纳米颗粒进行质量控制检测，通过测定其粒径、泽塔电位及时间稳定性来评估性能。最终，这些生物功能化纳米颗粒可用于多模态分子成像应用，结合荧光成像与磁共振成像（MRI），在混合细胞群体中可视化特定的靶向细胞亚群。

目前的商用成像试剂通常为单模态，仅能提供解剖学水平的分辨率。普鲁士蓝纳米颗粒结合了两种互补的成像模式——磁共振成像（MRI）和荧光成像，可实现分子水平和亚细胞水平的成像。多模态纳米颗粒的应用不仅涵盖癌症和炎症性疾病的诊断，还可用于监测其治疗反应。

这是因为经过生物功能化的纳米颗粒能够靶向并结合体内特定区域的一群细胞。尽管该方法可为癌症和炎症性疾病的诊断及治疗反应提供见解，但它也可应用于其他病理状况，从而受益于分子成像的灵敏度和特异性。通过荧光和磁共振成像（MRI），我们首次提出制备此类纳米颗粒的想法，当时我们发现普鲁士蓝——一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准可供人类口服的试剂——可通过单组分合成方案稳定合成，并能利用标准的生物偶联技术进行稳健的生物功能化。

首先，将五氧化高铁酸钾配制成5百万摩尔浓度的溶液，溶于5毫升去离子水中，制备溶液A。接下来，配制溶液B，其中包含2.5毫摩尔的三氯化铁和2.5毫摩尔的二氯化锰，溶于10毫升去离子水中，用于合成锰普鲁士蓝纳米颗粒。其他纳米颗粒的合成方法可参见文本方案。将溶液B转移至圆底烧瓶中，并在室温下以1000转/分钟的速度搅拌溶液。

使用蠕动泵将溶液A以每小时10毫升的速率逐滴加入容器中。加完溶液A后，将混合物在1000转/分钟下继续搅拌30分钟。然后将1毫升该混合物分装至微量离心管中，每管加入0.2毫升5毫摩尔氯化钠溶液。

将离心管在20,000 × g条件下离心至少10分钟，然后小心移除上清液，保留纳米颗粒沉淀。接着，向每份沉淀中加入1毫升去离子水。使用微量移液器枪头通过超声处理使纳米颗粒在溶液中均匀悬浮。

最终离心后，至少再洗涤纳米颗粒三次，以去除悬浮液中初始反应的组分；按照文本方案所述，用荧光素对纳米颗粒进行包被后，将其重新悬浮于1毫升去离子水中；取出生物素化抗体储备液。此处使用抗神经胶质抗原2和抗人嗜酸性粒细胞趋化因子3。将生物素化抗体转移至0.2微米尼龙微量离心滤膜管中，然后以14,000 × g离心10分钟。

接下来，每毫克包被腺病毒的纳米颗粒加入不超过 0.05 毫克的抗体，并用铝箔包裹管子以避光。在 4°C 下轻轻振荡孵育 2 至 4 小时。抗体结合完成后，取 10 微升浓度为 1 毫克/毫升的纳米颗粒样品加入到 990 微升去离子水中，盖上一次性塑料微量离心管盖，涡旋混匀。

然后使用测量角度为173度的动态光散射系统测定纳米颗粒的平均尺寸。首先，在PBS中制备10毫升细胞悬液，细胞浓度约为每毫升100,000个细胞；对于混合培养物，应按照文本方案中所述，制备含有不同比例各细胞系的试管。向每支试管中加入2毫升5% BSA，以封闭细胞并尽量减少非特异性结合。然后向每支试管中加入1毫升浓度为1毫克/毫升的生物功能化纳米颗粒，并将混合物孵育1小时。

接下来，将离心管在1000 × g条件下离心5分钟，去除未结合的纳米颗粒，并用1毫升PBS重悬细胞沉淀。此步骤至少重复两次。使用PBS中的10%甲醛固定细胞，然后加入PBS中含10微克/毫升的七氨基放线菌素D（7-amino actinomycin D）对细胞进行染色，将离心管置于冰上孵育30分钟，随后用PBS洗涤细胞。

接下来，将样品加入流式细胞仪，分析每份样品中10,000个门控细胞。文中方案描述了使用激光共聚焦显微镜成像结合荧光纳米颗粒的细胞的类似步骤。首先，在T75培养瓶中培养细胞至约80%融合度，然后用5毫升PBS洗涤细胞以去除培养基。

加入5毫升含1% BSA的PBS，封闭细胞1小时。然后向培养瓶中加入5毫升浓度为0.5毫克/毫升的抗体包被纳米颗粒，孵育细胞1小时，使纳米颗粒与细胞结合。接着用5毫升PBS洗涤细胞3次，以去除未结合的纳米颗粒。

然后加入 2 毫升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 溶液，将细胞置于 5 分钟以使细胞从培养瓶上脱落。加入 8 毫升 DMEM 以终止胰蛋白酶的消化作用，随后将细胞悬液转移至离心管中。以 1000 ×g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。

接下来，吸除上清液，并将细胞重悬于 1 毫升 PBS 中。加入 1 毫升含 10% 甲醛的 PBS 以固定细胞，然后将每份样品各 100 微升转移至 96 孔平底板的独立孔中。向每个孔中加入 100 微升熔化的 1% 琼脂糖水溶液，并用移液器吹打混匀。

将凝胶在 4 摄氏度下静置 12 小时，使其完全固化，形成模体。凝胶固化后，将模体与一块尺寸为 150 厘米立方、含 2% 琼脂的固体块并排置于水平方向的 3 T 临床磁体中。随后，将模体和琼脂块固定于八通道 HD 脑线圈中心位置，用于测量弛豫时间，采用冠状面切片，厚度为 0.5 毫米，切片位置位于 96 孔板高度的中点。使用动态光散射实验测定所生成纳米颗粒的流体动力学直径。稳定性研究验证了纳米颗粒的长期稳定性，这些纳米颗粒被用于基于水和基于细胞培养基的实验中。

激光共聚焦显微镜显示，负载针对嗜酸性粒细胞衍生神经毒素（EOT）抗体的荧光纳米颗粒特异性结合于嗜酸性粒细胞（EOL）1型细胞表面。当使用针对NG2的抗体时，它们特异性结合于BSG神经球的表面。通过流式细胞术检测，这些生物功能化的纳米颗粒能够成功地对目标细胞群体进行荧光标记。

此外，即使在靶细胞与对照细胞比例较低的情况下，这些纳米颗粒仍能够靶向混合物中的特定细胞亚群。最后，经生物功能化的纳米颗粒增强了靶向细胞的磁共振成像（MRI）对比度，即用装载了造影剂的纳米颗粒处理的细胞。与经对照颗粒处理的细胞相比，两种抗体在T1加权序列中显示出高信号强度。

相比之下，A NNG两种纳米颗粒在T2加权序列中表现出比对照颗粒更低的信号强度。一旦掌握。如果操作得当，生物功能化普鲁士蓝纳米颗粒的合成可在两天内完成。

与本实验方法类似，可通过将纳米颗粒与不同的生物聚合物和靶向配体进行生物功能化，以研究新的疾病和新的病理状态。观看本视频后，您应能充分理解如何合成普鲁士蓝纳米颗粒，用于荧光和成像应用以标记细胞群体。请务必严格遵守在临床 MRI 磁体中开展研究时的安全指南和标准操作规程。