利用多模态非线性光学显微技术对细胞摄取纳米颗粒的生物分子成像

本方案介绍了一种多模态非线性光学显微技术，并将其应用于癌细胞中金纳米颗粒的化学特异性成像。本成像系统的主要优势在于能够以多模态方式对细胞结构的生物分子对比度及金纳米颗粒进行观察。首先，除遥控盒外，打开所有设备的电源开关。

然后，打开控制盒背面的电源开关，待控制盒上的远程指示灯变为蓝色后，按下“开始操作”按钮。随后，启动激光扫描显微镜的计算机，并运行共聚焦显微镜软件。接着，通过计算机软件检查显微镜的光路，并通过触摸屏、遥控旋钮或计算机软件调节焦距。

在软件中选择所需的图像设置，包括缩放倍数、图像尺寸（像素）和像素驻留时间，同时确保像素驻留时间大于积分时间。将一滴去离子水置于水浸物镜上方，该物镜用于将激光束聚焦到样品中，并在聚光镜与样品之间用于成像。然后，调节聚光镜的高度至样品上方约一毫米处，以收集最大量的光，并将置于可移动支架上的SRS探测器移出光路，以便使用白光对样品进行聚焦。

使用软件设置，选择泵浦光束，并将激光波长调整为802纳米（用于CH振动）和898纳米（用于酰胺I峰），以适应拉曼位移的较大变化。若需对拉曼位移进行微调，请按照文中的描述，在SFTRU单元中扫描延迟阶段。对于高光谱数据集，选择“触发”选项卡，点击“TTL触发启动”，然后选择“每帧触发”。

接下来，在“序列”选项卡中，开启时间序列并关闭Z序列。此外，将时间序列中的帧数设置为与ATM软件中的步数相匹配。随后，进入ATM软件中的“运行”选项卡，将CH区域的延迟台位置设置为90.25和92.25，而酰胺I区域则设置为89和91（单位：毫米），分别对应高光谱扫描的起始和终止位置，同时确保步数与计算机软件中的帧数一致。

检查设置无误后，在计算机软件中开始高光谱扫描堆栈，首先点击“采集”（Acquire），然后点击“开始扫描”（Start scan）。接着，在ATM软件中点击“开始”（Start），系统将从选定的起始位置到终止位置之间，逐步增加延迟阶段的位置，从而采集一系列图像。随后，在不同的延迟阶段位置采集时间序列图像，以生成高光谱扫描数据。

使用模拟单元，向 SFTRU 系统发送和接收 TTL 信号，以同步图像采集与延迟台的移动。在 CH 振动区域与酰胺 I 振动区域之间切换成像时，需在激光软件中将泵浦光波长从 802 纳米更改为 898 纳米。此外，还需在 ATM 软件中将斯托克斯色散设置从 30 毫米更改为 5 毫米。

调节SFTRU盒内泵浦光束色散光路中镜架上的下部旋钮，通过微小增量改变镜片角度，从而对镜片进行微调。为验证聚苯乙烯微球的化学选择性，记录了高光谱受激拉曼散射和自发拉曼光谱。除相对强度上观察到的差异外，两组光谱完全一致。

在波数为 2,852、2,930 和 2,968 cm⁻¹ 处对 4T1 癌细胞进行了受激拉曼散射成像，这些波数分别对应脂质、蛋白质和 DNA 生物分子的碳-氢键伸缩振动带。对经金纳米颗粒处理的 4T1 癌细胞进行了多模态成像，以研究纳米颗粒在癌细胞中的分布情况。所获得的受激拉曼散射图像包括 CH₂ 和 CH₃ 通道、LysoTracker 荧光探针以及非共振受激拉曼散射通道的成像结果。

需要牢记的最重要事项是在激光软件中更改振动区域的泵浦参考，并在实验方案中同时调整斯托克斯色散设置。该系统可轻松在飞秒与皮秒区域之间切换，而不会影响光学准直。这一能力使我们能够开展多光子相干拉曼散射和泵浦-探测光谱及其相关应用研究。

该多模态成像平台为纳米医学提供了新的见解，并为细胞、组织和金纳米颗粒的分子成像开辟了道路。