一种测定小鼠冷敏感性与冷适应的简单且经济的方法

本实验的总体目标是测量小鼠对寒冷的反应性。首先将玻璃表面冷却或加热至所需温度，以实现这一目标。第二步是使小鼠适应环境，直至其处于静息状态。

第三步是将干冰粉末在注射器中压制成颗粒。最后一步是使用干冰颗粒和秒表测试小鼠，以测量其缩足潜伏期。最终，冷板实验用于测量自由活动小鼠对冷刺激的反应性及适应性。

与现有的丙酮试验和冷板试验相比，我们的检测方法主要优势在于，可以在多种环境条件下，于基线状态同时检测痛觉过敏和镇痛效应。尽管该方法能够揭示小鼠对冷刺激的反应性，但它也可应用于其他系统，例如猴、大鼠以及人类。本实验操作将由我实验室的研究生 Daniel Brenner 演示。

清洁玻璃表面后，使用实验室胶带将T型热电偶探头固定在玻璃板中央的表面上。将动物饲养盒沿中线单排放置在玻璃板上。然后将热电偶探头穿过中央的动物饲养盒，并插入数据记录仪中。

打开数据记录仪并关闭自动关机功能。使用提供的数据线将数据记录仪连接到计算机。使用黑色隔板将动物饲养盒分隔开，以防止小鼠之间发生视觉接触，并在玻璃下方放置镜子，以便观察饲养盒的底部。

开始测试时，将铝制盒子放置在动物两侧的玻璃板上，盒子与动物围栏保持固定距离。若在30摄氏度下进行测试，将加热循环水装置连接到距离动物围栏0.25英寸的铝制盒子上。在堵住排水孔的同时，向盒子中注入半满的水。

将循环水浴装置放置在适当位置，使铝盒中的热水能够直接回流到两侧循环水浴的储水槽中。需向每个循环水浴中加水。待金属盒注满水后，将循环水浴温度设定为 45 至 60 摄氏度，并持续注入热水以填满铝盒。

当载物台温度达到所需范围后，将小鼠放入载物台上的围栏中。让小鼠适应仪器和温度环境，适应时间为2.5小时。

接近适应期结束时，在行为学实验室外取一个冰桶，装入约半桶干冰，并使用锤子或橡胶锤将干冰敲碎成粉末，以避免干扰小鼠。随后，使用刀片或剪刀将一个3毫升注射器的顶部剪去。

然后使用21号针头在注射器相对的两侧各打三组孔，以减少在行为学实验室内压缩干冰时因升华产生的压力。将注射器腔体装入约一半体积的干冰粉末。将注射器切口端紧贴一个平面物体，用活塞用力压缩粉末。将压缩后的干冰柱体尖端伸出注射器边缘。

现在，测试那些四只爪子都在玻璃上、未移动但尚未完全入睡的小鼠。使用镜子进行准确定位后，轻轻但牢固地将扁平颗粒压在小鼠后爪下方的玻璃表面，同时启动计时器。

当小鼠的爪子从冷却的玻璃表面移开（无论是垂直还是水平方向）时，停止计时并移除干冰颗粒。然而，如果小鼠的爪子只是短暂移动后又立即回到冷却表面，则继续计时和刺激，直到小鼠彻底离开冷却表面为止。如果小鼠在20秒内未主动移开，则在20秒后停止刺激。

重复此测试程序，直至收集到每只动物每只爪子至少三个数值，以在17摄氏度条件下测试小鼠。重复上述实验操作，但不再向铝制盒子中注入加热的水，而是使用湿冰，并将盒子放置在距离饲养箱约0.25英寸的位置以测试小鼠。在12摄氏度条件下使用干冰，但盒子应放置在距离饲养箱约1.25英寸的位置。

该替代方案在平板温度下降过程中而非温度稳定后对小鼠进行测试。这使我们能够在小鼠适应过程中实时检测其适应能力。在设置好仪器后，首先按照前述方法进行实验，于室温条件下采集测量数据。

在室温下测量完基础潜伏期后，使用先前展示的步骤，将空的铝盒装入干冰，并将其放置在两侧距 enclosure 1.25 英寸的位置。最后，重复实验，以获取玻璃板冷却过程中的潜伏期测量值。

尽可能频繁地进行测量。该图显示了小鼠在起始温度分别为12摄氏度、17摄氏度、23摄氏度或30摄氏度时的平均缩足潜伏期。在所有温度条件下，缩足潜伏期均保持一致。

镇痛效果可通过冷板实验进行测定，如图所示。皮下注射1.5毫克/千克吗啡后30分钟，小鼠的缩足潜伏期显著延长，该结果通过双因素方差分析结合注射后60分钟的Bonferroni事后检验测定。吗啡注射组与生理盐水注射组之间无显著差异。

此处也可测量小鼠的过敏反应。通过足底注射 10 微升完全弗氏佐剂，可在注射后 2 小时和 3 小时时显著降低小鼠的缩足潜伏期，该结果经双因素方差分析（two-way ANOVA）结合 Bonferroni 事后检验测定。同一批小鼠在注射后 4 小时接受皮下注射吗啡，于 4.5 小时测得的所有缩足潜伏期均较 3 小时显著升高，该结果经单因素方差分析（one-way ANOVA）结合 Dunnett 事后检验测定。

在注射后5.5小时，吗啡已被代谢时，通过双因素方差分析结合Bonferroni事后检验发现，注射CFA的小鼠仍比注射生理盐水的小鼠表现出更短的撤药潜伏期。该检测方法可实时测量对降温环境变化的适应能力。随着玻璃板温度降低，野生型小鼠的撤药潜伏期保持不变，表明它们对降温的适应速度超过了CPA所能检测的范围，各组之间无显著差异。

然而，当小鼠被注射U 7 3 1 2 2以阻断PIP₂水解后，随着温度平台的温度降低，其潜伏期缩短，表明其适应能力受损。一旦掌握该技术，包括适应时间在内，整个实验可在五小时内完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何在清醒且自由活动的小鼠中测量冷觉感知及其适应能力。请务必注意，操作干冰具有极高的危险性，需确保实验过程中有适当的通风和空气流通。