细胞系和组织样本中去泛素化酶活性的检测方法

以下实验的总体目标是可视化细胞中去泛素化酶的活性。首先将细胞培养至高汇合度，然后收集细胞，以制备浓缩的裂解液。通过温和的机械裂解方法制备裂解液，以保持细胞胞质的代谢状态。

接下来，将酶与血凝素衍生的探针共同孵育，通过与活性位点的半胱氨酸残基发生反应，从而标记去泛素化酶。结果通过蛋白质印迹及随后的化学发光检测，显示出多种去泛素化酶的活性谱。该技术相较于常规蛋白质印迹等现有方法的主要优势在于，能够使研究人员同时观察多种酶的活性。在一项实验中，将30毫升Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）加入10%胎牛血清，混匀后转移至50毫升锥形管中，用于细胞培养。

将用于实验的细胞从液氮储存中取出，迅速转移至含有温水的小烧杯中。随后，将细胞转移至含有30毫升培养基的50毫升锥形管中。接着，在解冻后5秒内，向细胞冻存管中加入一些培养基，并将重悬的细胞转移至培养容器中。

以450 ×g离心细胞悬液5分钟，以获得细胞沉淀。然后向T75培养瓶中加入20毫升培养基。用抽吸法移除细胞中的培养基。

向细胞沉淀中加入5 mL新鲜培养基并重悬。将5 mL细胞悬液转移至T75培养瓶中的20 mL培养基中，在37°C条件下培养。每三天更换一次培养基以收获细胞。

通过抽吸去除培养基，注意不要触碰细胞。用五毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。通过抽吸去除 PBS。

接着，向T 75培养瓶中加入3 mL胰蛋白酶EDTA，于37°C孵育3分钟。孵育结束后，向培养瓶中加入6 mL新鲜培养基，重悬细胞。

将悬液转移至15毫升锥形管中，在290 G下离心5分钟，弃去上清液，加入5毫升PBS。轻轻敲击管底以重悬沉淀，然后在290 G下再次离心5分钟。重复PBS洗涤三次后，弃去旧的PBS，并将细胞重悬于1毫升新鲜PBS中。

然后将细胞转移至离心管中，在290 ×g条件下离心5分钟。进行细胞裂解时，使用移液器估测沉淀的体积，并按1:1的质量与体积比称取玻璃珠。向沉淀中加入裂解缓冲液，体积为沉淀体积的两倍。

然后将玻璃珠加入沉淀物中，并在低温室中于4°C条件下，通过涡旋振荡在最大振荡速度下裂解细胞30分钟。随后在200 ×g下短暂离心30秒。

为使珠子沉淀并收集上清液。向上述上清液中加入与之前相同体积的玻璃珠，再次在4°C条件下以最大转速涡旋振荡30分钟，振荡前先短暂离心，200 ×g 离心30秒。待玻璃珠沉淀后，收集上清液。

最后在5,030 ×g下离心5分钟。为去除细胞核、膜成分及未破碎的细胞，收集上清液，即为用于组织衍生化的细胞裂解液，该步骤可通过戊二醛或BCA分析完成。在96孔板中，按照BCA蛋白检测试剂盒说明书，使用比色法96孔板读板仪测定裂解液的蛋白浓度。

确定蛋白浓度后，取相当于20微克总蛋白的样品，用去离子水补足至50微升。然后向溶液中加入2微升浓度为1.35微摩尔的HAUB乙烯基细胞探针。最终反应体系中，裂解液中的蛋白量为20微克，探针浓度为50纳摩尔。

这处于大量摩尔过量状态。为确保功能性的去泛素化酶（deubiquitin enzymes 或 DUBs）被标记，请将溶液在 37 摄氏度下孵育一小时。接着，向溶液中加入上样缓冲液（laly sample buffer）。

对于52微升的反应体系，使用26微升的2×上样缓冲液、13微升的4×上样缓冲液或8.87微升的6×上样缓冲液。将样品在95摄氏度下孵育5分钟，然后置于冰上冷却。

在进行 Western 印迹实验加载凝胶之前，先将 40 微升制备好的样品加入 12 孔 4%～20% Tris-甘氨酸凝胶中。以 95 伏电压电泳，直至离子前沿迁移至凝胶底部。随后，按照以下步骤将凝胶中的蛋白在转膜装置中过夜转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。

首先转移，将膜置于AMDO黑色染色液中孵育，并扫描膜以获得显示每条泳道中蛋白质含量的图像。随后，将膜进行脱色处理，并在含5%脱脂奶粉的PBS中孵育一小时以封闭。接下来，将膜与一抗HA抗体在含5%脱脂奶粉的PBS中孵育，抗体稀释比例为1:10,000，可在4°C孵育过夜，或在室温孵育4小时。

孵育后，用含0.1%吐温20的PBS缓冲液洗涤三次，每次五分钟。然后将膜置于含5%脱脂奶粉的PBS溶液中，加入辣根过氧化物酶标记的鼠源一抗（工作浓度为1:10,000），于室温孵育至少两小时。按前述方法洗涤三次，再用PBS缓冲液洗涤一次，每次五分钟。

最后将膜在化学发光检测试剂中孵育10分钟，并使用化学发光检测仪进行检测。检测时采用检测仪的自动曝光设置。蛋白上样量使用AM线粒体黑色染色法进行检测。

此对照步骤可确保观察到的活性差异源于真实的细胞过程，而非蛋白质上样量不均所致。本图所示泳道表明，第一次实验中使用了等量的蛋白质。在第二次实验中，由于预期不同细胞系的活性谱存在差异，因此上样的蛋白质用量不等。

这样做的目的是确保检测到M 17细胞的活性谱。将裂解液与乙基马来酰亚胺（一种半胱氨酸抑制剂）共同孵育，应会导致Western印迹信号减弱。随后将膜与抗HA一抗共同孵育。

小鼠辣根过氧化物酶，然后通过化学发光成像进行检测。使用探针成功标记去泛素化酶后，会在膜的每条泳道中显示出相应的条带。不同分子量处条带的强度对应于去泛素化酶的活性水平。

当在 HEK293 和 M17 细胞中比较 UCHL1 等相似蛋白时，不同细胞系中各种去泛素化酶活性水平的差异变得明显。经过该步骤后，可进行亚细胞组分分离等其他方法，以回答诸如病理性过程如何影响膜结合细胞器中泛素酶活性等问题。

观看本视频后，您应能充分理解如何使用活性位点定向探针来检测去泛素化酶的活性。