量化啮齿类动物大脑中亚细胞水平的泛素-蛋白酶体活性

该方案可检测啮齿类动物脑组织中亚细胞水平的蛋白质泛素化程度及蛋白酶体活性，从而在同一个体内部比较泛素-蛋白酶体系统活性在细胞活动、学习或疾病状态下的变化情况。本方案允许从同一只啮齿类动物脑组织中分离突触、胞质和核组分。该方法损失小，适用于少量组织样本，并可使用常规实验室设备完成。

本实验操作将由我实验室的研究生 Taylor McFadden 演示。请按照文本方案中所述，首先进行啮齿类动物脑组织的采集与解剖。确保每个实验组的不同提取条件下，所使用的脑半球是交叉平衡的。

从–80摄氏度冰箱中取出含有目标区域半脑的1.5毫升离心微量管。使用解剖刀将冷冻脑组织转移至2毫升玻璃特氟龙匀浆器中。向特氟龙管中加入500微升裂解缓冲液。

使用研杵B，以15次研磨充分匀浆组织，直至肉眼不可见任何固体物质。每次研磨时应采用旋转动作。用1,000微升移液器将匀浆后的样品转移至新的1.5毫升微量离心管中。

将离心管置于湿冰上，孵育30分钟。将离心管放入微量离心机中，在4°C条件下以845 ×g离心10分钟。离心结束后，小心用移液器吸除上清液，并转移至新的1.5 mL微量离心管中。

这是细胞质组分。向所得沉淀中加入50 µL提取缓冲液，用移液器吹打重悬。切勿涡旋沉淀。

将含有重悬沉淀的离心管置于冰上，孵育30分钟。然后在4°C条件下，以21,456 ×g离心20分钟。离心结束后，小心用移液器吸除上清液，并转移至新的1.5 mL微量离心管中。

这是核组分。将目标区域的半侧脑组织按前述方法匀浆，但使用500微升TEVP缓冲液代替裂解缓冲液。使用1,000微升移液器，将匀浆后的样品转移至新的1.5毫升微量离心管中。

在4 °C条件下，以1,000 × g离心样品10分钟。使用1,000 µL移液器收集上清液，并转移至新的1.5 mL微量离心管中。在4 °C条件下，以10,000 × g再次离心样品10分钟。

弃去含有细胞核和大颗粒碎片的原始沉淀物。将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中。此为胞质组分。

向沉淀中加入50 µL裂解缓冲液，通过移液吹打重悬，直至无可见固体物质。在4 °C条件下，以20,000 ×g离心10分钟。将上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中。

这是粗制突触体膜组分。进行检测前，将酶标仪预热至37摄氏度，并在整个运行过程中保持该温度。设置激发波长为360纳米，发射波长为460纳米。

如果使用的96孔板为透明板，将光学检测位置设为底部；如果使用黑色96孔板，则将光学检测位置设为顶部。设置动力学检测程序，总时长为两小时，每30分钟扫描一次。

使用 13.5 毫升超纯水重悬试剂盒中提供的 20S 10X 检测缓冲液。向现已稀释为 1X 的缓冲液中加入 14 微升 100 毫摩尔 ATP。这将显著增强样品中蛋白酶体的活性，并提高检测的可靠性。

使用100微升DMSO溶解试剂盒中提供的AMC标准品。由于该标准品对光敏感，操作AMC标准品时应在避光或低光照条件下进行。通过一系列从高到低的AMC浓度建立AMC的标准曲线。

该曲线将用于酶标仪的校准以及对匀浆样品中蛋白酶体活性的分析。用65 µL DMSO溶解试剂盒中提供的蛋白酶体底物。同时，此步骤需在避光或低光照条件下进行，因为底物对光敏感。

然后在新的 1.5 毫升微量离心管中，使用 20S 检测缓冲液将蛋白酶体底物稀释至 1:20。将等量的待测样品加入 96 孔板中。每个样品设置两个复孔。

所需样品的量取决于组织制备方式。通常，任何亚细胞组分有10至20微克即足够。用超纯水将样品体积补足至80微升。

加入的量取决于所加样本的体积。在两个独立的孔中，各加入80微升水。这些孔将作为检测空白对照。

向每个孔中加入10 µL 20S检测缓冲液，包括检测空白孔。使用排枪或自动移液器以确保各孔间的检测体积一致。关闭灯光或进入暗室。

使用单个孔分别加入稀释后的AMC标准品，将全部100微升加入新孔中。在避光条件下，使用多通道移液器或自动移液器向含有样品和检测空白的孔中加入10微升稀释的蛋白酶体底物，但不加入AMC标准品。将酶标板放入酶标仪中，并启动动力学检测程序。

使用多种标准的蛋白质印迹（Western blotting）方法，结合特异识别不同连接方式的多聚泛素抗体，对从啮齿类动物脑组织中分离的不同亚细胞组分中的多种多聚泛素标记进行定量分析。某些泛素蛋白印迹图像会呈现由清晰条带组成的列状信号，而另一些则呈现弥散的涂布样模式，仅有少数或无明显条带。在对成像后的泛素蛋白印迹进行定量时，应围绕目标条带列绘制一个矩形框，该框需覆盖整个分子量标准蛋白梯度的范围。

如果泛素染色确实贯穿整个蛋白条带，则调整该区域。这种情况在赖氨酸48修饰中较为常见，且在不同亚细胞结构中差异显著。最后，扣除背景值，背景值计算为泳道四周紧邻区域的平均光密度。

图中显示了从同一只动物的侧杏仁核不同组分中检测到的蛋白酶体活性定量结果。在体外蛋白酶体活性检测过程中，突触组分、胞质组分和核组分中的相对荧光单位（RFU）在检测期间均随时间逐渐增加。蛋白酶体抑制剂 beta-lac 阻止了各组分中 RFU 在检测过程中的变化。

在同一动物的侧杏仁核中观察到蛋白酶体活性存在亚细胞水平的差异。与对照组相比，训练组动物细胞核内的蛋白酶体活性升高，而突触组分中的活性则相应降低。细胞质中的蛋白酶体活性保持在基线水平。

图中显示了同一动物在学习后，其侧杏仁核中不同亚细胞区域蛋白质泛素化修饰位点特异性的差异。学习后，细胞核组分中的总体泛素化水平升高，而胞质组分中的泛素化水平则相应降低。学习后，细胞核组分中的线性泛素化有所增加，但在胞质组分或突触组分中未见增加。

有趣的是，学习后细胞核组分中的K63泛素化水平升高，而突触组分中的K63泛素化水平则相应降低。而K48泛素化在学习后于细胞核和细胞质组分中均升高，但在突触组分中未见升高。该方案也可用于研究同一动物体内其他蛋白质的亚细胞分布及其功能。