通过共定位分析追踪药物诱导的受体内在化后转运变化

以下实验的总体目标是定量评估目标分子对的空间共定位情况，本实验中特指药物诱导的受体转位。首先通过药物处理活体培养细胞，诱导受体转位的发生。第二步，对目标受体和细胞内转位区室进行双重免疫标记，随后利用多通道共聚焦显微镜观察目标分子对的空间定位。

定量共定位分析用于测量靶向受体与细胞器倾向于存在于相同位置的程度。结果展示了药物处理后受体运输的变化，该变化基于受体与细胞内运输细胞器之间的共定位情况。与现有的叠加共定位等方法相比，该技术的主要优势在于能够提供共定位的量化指标，从而支持更强大的数据分析和更复杂的实验设计。

尽管该方法可用于研究受体的转运过程，但它也可用于检测培养细胞中任意两种蛋白质之间空间共定位的变化。开始此操作时，移除原有的生长培养基，并替换为含有选定浓度目标药物的新培养基。接着，在原有的培养条件下孵育细胞，持续时间为选定的处理时长。

孵育后，每次用一毫升洗涤缓冲液轻轻洗涤细胞，共洗涤三次。在37摄氏度下，用300微升含有4%多聚甲醛的0.1摩尔PBS固定细胞10分钟。然后再次每次用一毫升洗涤缓冲液轻轻洗涤细胞，共洗涤三次。

随后，在300 µL封闭缓冲液中室温孵育细胞2小时。然后，在4 °C条件下，将细胞与一抗在300 µL抗体稀释液中孵育48小时。接着，每次用1 mL洗涤缓冲液轻轻洗涤细胞，共洗涤3次。

接下来，在300 µL抗体稀释液中加入与荧光染料偶联的二抗，室温避光孵育细胞1小时。1小时后，每次用1 mL洗涤缓冲液轻轻洗涤细胞，共洗涤3次。从24孔板中取出盖玻片时，将板倾斜45度角。

将精细镊子的尖端置于盖玻片顶部边缘与孔板底部相接处，然后轻轻将盖玻片向远离孔板底部的方向倾斜，使其进入洗涤缓冲液中。盖玻片将贴靠在孔壁上，随后可用镊子轻松取出。

然后使用100倍高倍物镜，将带有细胞的一面朝下，用抗荧光淬灭封片剂将盖玻片封固在显微镜载片上。首先，利用落射荧光找到一个具有代表性的待成像细胞。接着，设置图像采集参数，对每个标记通道依次采集8位未压缩的TIFF图像，并对每个通道进行4到6次扫描取平均，以获得最终图像。

然后切换到共聚焦成像光路，并聚焦于穿过细胞中心的Z平面。针对每个通道优化针孔、激光功率以及光电倍增管的电压和偏移。记录这些设置参数，并在对所有标记了相同目标对的细胞进行成像时使用相同的设置。

使用相同的复制定位功能，对需要以高倍物镜成像的细胞进行定位。利用落射荧光，切换至共聚焦成像光路，并将焦平面聚焦于细胞中心所在的Z平面（若可获取）。随后，使用软件的缩放裁剪功能，将扫描区域限制在目标细胞范围内。

使用先前设定的参数采集每个标记通道的图像，并对每种条件下的每个重复样本重复操作，以成像15个或更多细胞，确保获得足够的样本量。在此步骤中，于ImageJ中打开一对细胞图像，使用图像颜色合并通道命令生成RGB图像。

然后围绕目标细胞进行勾画。使用 ImageJ 插件 SC Colocalization 来量化所选细胞中目标蛋白的共定位情况。记录所需的共定位参数，并对每张图像中的细胞重复此操作。

接下来，计算每种标记条件下各重复实验中共同对照条件的记录共定位值的平均值。将这些平均值乘以负一，得到每种标记条件下各重复实验的偏移量。然后将每种标记条件下各重复实验的偏移量分别加到该重复实验的每个共定位值上。

这将对数据进行标准化处理，使得每种标记条件下各重复实验中共同对照组的平均共定位测量值为零。随后，通过整合每种标记条件下所有重复实验的数据，可实现对重复实验间共定位变化的分析。图中展示的是背根神经节感觉神经元的原代培养物，这些细胞接受了长期和急性药物处理。之后，对细胞进行免疫标记，分别使用不同的初级和次级抗体组合标记δ型阿片受体及再循环内体的标志物，并通过双通道顺序共聚焦显微镜成像。

除了后续的定量共定位分析外，这些代表性图像还经过处理，生成了此处所示的伪彩共定位图。比较了接受不同急性药物处理组之间δ阿片受体与早期内体、循环内体及溶酶体标志物的平均共定位评分，观察药物诱导的受体转运变化。在进行该实验操作时，需注意获取高质量且一致的显微图像，以确保定量分析的有效性。

观看本视频后，您应该能够充分理解如何进行定量共定位分析。