高分辨率时空分析受体动力学的单分子荧光显微技术

以下实验的总体目标是可视化活细胞表面的单个受体，并分析其定位、运动行为以及动态组装成超分子复合物的过程。该目标通过在活细胞表面以极低水平表达带有Snap标签的受体，并用高亮度的有机荧光染料对其进行标记，从而实现单分子水平的检测。第二步，利用全内反射荧光显微镜对细胞进行成像，从而获取细胞表面单个受体颗粒运动的快速图像序列。

接下来，将自动化检测与追踪算法应用于图像序列，以获取每个受体颗粒随时间变化的位置和强度信息。结果表明，在本示例中，可通过图像序列初始阶段颗粒强度分布的混合高斯拟合，精确分析受体复合物的大小，即β2肾上腺素受体。该方法有助于回答细胞生物学领域中的关键问题，例如我们的受体如何在活细胞表面的特定区域中组织排列。

它们如何相互作用形成二聚体和寡聚体，以及受体信号传导基础的动态事件究竟是如何发生的。该技术相较于常规生化和显微镜方法的主要优势在于，它能够在天然环境中研究单个受体的行为，从而让我们探究在群体测量中通常被掩盖的重要方面。样品的盖玻片必须彻底清洗，以尽量减少背景荧光。成像过程中，使用洁净的镊子放置直径为24毫米的盖玻片。

将玻璃盖玻片放入可分隔单个盖玻片的盖玻片架中。将装有盖玻片的架放入烧杯，并加入氯仿直至盖玻片完全浸没。用铝箔覆盖烧杯以减少蒸发，然后在水浴中超声处理。

在室温下超声处理一小时。一小时后，将盖玻片架从烧杯中取出，让盖玻片自然干燥。接着，将带有盖玻片的支架放入另一个烧杯中，并加入5摩尔的氢氧化钠溶液，直至完全浸没盖玻片。

与之前相同，用锡箔纸覆盖烧杯，在室温下超声处理一小时，将盖玻片架转移至新的烧杯中，并用蒸馏水洗涤三次。最后，将清洗干净的盖玻片放入盛有100%乙醇的玻璃细胞培养皿中。图中显示的是清洗前后通过全内反射荧光显微镜（TIRF）或表面粗糙度显微镜（turf microscopy）成像的盖玻片。

钙校准样品用于在草坪显微镜下估算单个荧光分子的强度。样品制备时，将荧光染料溶解于适当的溶剂中，并配制从一皮摩尔到一阿摩尔的1至10倍系列稀释液。

在滤膜除菌的水中清洗先前已清洁的盖玻片，将其转移至盛有滤膜除菌水的细胞培养皿中进行洗涤。随后，将每片盖玻片放入六孔细胞培养板的各个孔中，待其干燥后，分别在已清洁的盖玻片上点加20微升的不同荧光染料稀释液。

将盖玻片在无菌操作台中晾干。在转染前，避免光照和灰尘污染，妥善保存盖玻片。准备六孔细胞培养板，用无菌 PBS 清洗洁净的盖玻片，并将每张盖玻片放入六孔细胞培养板的各个孔中。

本研究中用于转染的CHO细胞在37摄氏度、5% CO2条件下培养，使用等体积混合的ECCOs改良Eagle培养基F12，添加10%胎牛血清、青霉素和链霉素。按照标准方法经胰蛋白酶消化并计数后，以每孔3 × 10⁵个细胞的密度接种于六孔细胞培养板中，孔内预先放置盖玻片。将细胞置于培养箱中培养24小时，使其融合度达到约80%，此为转染的最佳细胞密度。

本方案中最困难的部分是实现细胞表面膜受体极低的表达水平，以确保实验成功。转染条件，例如转染后添加培养基的量以及转染后的时间，必须在转染当天进行优化。

为每孔准备转染试剂：在另一管中，将两微克目标plaid DNA溶于500微升Opti-MEM培养基中。每孔将6微升Lipofectamine 2000溶于500微升Opti-MEM培养基中。将两管试剂在室温下孵育5分钟。

五分钟后，将两种溶液合并至同一离心管中并混匀，得到转染混合物。室温孵育转染混合物20分钟。在此期间，准备CHO细胞。

用预热的 PBS 洗涤细胞两次。第二次洗涤后，弃去 PBS，每孔加入 1 毫升不含抗生素、不含酚红的 D-M-E-M-F12 培养基，其中添加 10% FBS。将 1 毫升转染混合物逐滴加入每孔中，并轻轻前后摇动培养板，以确保充分混匀。在 37°C、5% CO2 条件下孵育 2 至 4 小时，随后立即进行蛋白质标记。

开始此实验步骤时，将一微升荧光四号偶联苯并喹啉衍生物（fluoro four conjugated benzo guine derivative）或荧光四号 BG 储存液加入一毫升含 10% FBS 的 D-M-E-M-F 12 培养基中，稀释至终浓度为一微摩尔。从培养箱中取出转染后的细胞，用预热的 PBS 洗涤两次。弃去 PBS，加入一毫升一微摩尔的荧光四号 BG 溶液，于 37°C、5% CO2 条件下孵育 20 分钟。

接着，每次使用添加了10% FBS的D-M-E-M-F 12培养基洗涤细胞三次，每次洗涤后于37°C孵育5分钟。用镊子将带有标记细胞的盖玻片转移至成像腔室，再用300 µL成像缓冲液洗涤两次。

加入 300 微升新鲜成像缓冲液，并立即进行成像。使用配备油浸、高数值孔径物镜、合适激光器、电子倍增电荷耦合器件相机、培养箱和温度控制装置的转盘显微镜。设置所需的显微镜参数，即激光波长、转盘角度、曝光时间、帧率以及每段视频的图像数量。

在显微镜的100倍油镜物镜上滴加一滴浸油。将载有标记细胞的成像小室放置在显微镜的样品架上，并调节焦距使细胞清晰可见。使用明场照明进行观察。

切换至落射照明。保持激光功率尽可能低，以便寻找目标细胞，同时最大限度减少光漂白。选择目标细胞并进行微调。

调整焦距。增加激光功率至能够观察到单个荧光点的水平。采集图像序列，并将原始图像序列保存为 tiff 文件用于校准。

在成像室中制备每个校准样品，并将其放置在显微镜上。选择含有清晰分离衍射信号的样品，且荧光斑点应表现出单步漂白特征。

随后以与标记细胞相同的方法获取草坪图像序列。为制备图像序列，使用图像处理软件（如 Image J）对图像进行裁剪，并将各帧单独保存为 TIFF 图像，存入新文件夹中，每个图像上需标明帧编号。

使用非商业软件（例如 MATLAB 环境中的 U Track）进行颗粒检测与追踪。在 MATLAB 命令提示符中输入 movie selector, GUI，以打开视频选择界面，并按照说明从先前保存的独立图像开始创建新的视频数据库。

输入用于颗粒检测与追踪的像素尺寸（纳米）、时间间隔（秒）、数值孔径、相机位深以及荧光染料的发射波长。从视频选择界面保存视频数据库。运行分析，选择单颗粒作为分析对象类型。

运行检测算法，然后运行跟踪算法。使用 URAC 软件包中包含的视频查看程序来可视化轨迹，并检查检测与跟踪的质量。打开点状 MAT 文件，查看每帧中被跟踪粒子的位置和振幅。

颗粒的大小也可以通过获取的数据进行计算。此处显示的是转染了 SNAP标记的β2肾上腺素受体并用荧光四号偶联的苄基鸟嘌呤衍生物标记的细胞的典型草坪图像序列的第一帧。这些斑点代表单个受体或受体复合物。

将检测算法应用于同一图像序列，每个检测到的粒子由蓝色圆圈标示，并通过应用跟踪算法实现。对同一图像序列进行处理，得到由蓝色线条表示的各个粒子的轨迹。绿色线段代表合并事件，红色线段代表分裂事件。

该方法还可捕获动态事件。在此示例中，两个颗粒发生短暂相互作用，共同移动若干帧后再次分离。通过各个颗粒的轨迹可计算其扩散系数。

此代表性结果表明，β2肾上腺素能受体具有较高的迁移率，而GABA B受体的迁移率则较为有限。通过混合高斯模型对颗粒强度分布进行拟合，可精确估算受体复合物的大小。该分析还可揭示单体与二聚体的共存情况。

此处展示的是单体受体颗粒一步光漂白和二聚受体颗粒两步光漂白的示例。这些方法可进一步拓展并调整，以适用于其他细胞表面蛋白、均一化方法及细胞模型。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备洁净的盖玻片，如何获得低表达水平并使用高亮度有机荧光染料实现高效标记，以及如何采集和分析单分子成像图像，这些均为成功开展单分子实验的关键步骤。