通过RAFT控制聚合简便高效地制备三组分荧光糖聚合物

本实验的总体目标是利用可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合技术，实现荧光性随机线性糖聚合物的精确可控合成。该目标通过两个步骤完成：首先合成糖单体——乳糖基乙基甲基丙烯酰胺（Lactobioyl ethyl methacrylamide，L-A-E-M-A）；第二步是利用RAFT聚合方法，将L-A-E-M-A与N-氨基乙基甲基丙烯酰胺（AEMA）以及N-羟乙基丙烯酰胺（AGAA）共聚，合成相应低分散度的糖聚合物。

接下来，通过将糖聚合物的一个伯胺基团与羧基荧光素琥珀酰亚胺酯反应，对糖聚合物进行修饰，从而生成荧光素标记的糖聚合物。最后一步是将荧光素标记的糖聚合物与已知碳水化合物结合特异性的凝集素包被的琼脂糖微珠结合。最终，利用荧光显微镜分析糖聚合物与琼脂糖微珠的结合情况，以确认该糖聚合物含有目标碳水化合物，并已成功标记荧光标签。

与采用传统自由基聚合的现有方法相比，RAF聚合的优势在于该过程是一种可控聚合技术，可最大限度地减少由引发剂衍生的链数量。这使得所得到的聚合物具有预定的分子量和极窄的多分散性指数。该聚合方法可应用于特定单体混合物，以制备特定的荧光糖聚合物。

这些糖聚合物具有明确的结合能力，可通过使用凝集素包被的微珠进行验证。高效制备荧光糖聚合物在未来将对糖生物学研究具有重要价值。首先，将两克乳糖酸溶解于三毫升无水甲醇中。

接着，缓慢地将无水乙醇逐滴加入溶液中，直至溶液刚刚变为浑浊。使用旋转蒸发仪除去所有溶剂。重复此过程三次，得到1.94克乳酸生物素五内酯，产率为98%。

将1克乳酸生物内酯溶于3毫升甲醇的溶液加入到含AEMA和MEHQ的2毫升甲醇溶液中。随后，加入1毫升三乙胺，并在室温下搅拌混合物。48小时后，向混合物中加入20毫升去离子水，并转移至旋转蒸发仪中。

蒸发至完全干燥。将残余物溶解于20毫升去离子水中，并将溶液上样至一根10乘20毫米的阴离子交换柱顶部。在出口下方放置一个含有1毫克MEHQ的烧杯，并用洗脱液将柱子洗脱至该烧杯中。

用旋转蒸发仪蒸干溶液后，将残留物溶于20毫升去离子水中，并加入1毫克一份的离子交换树脂。持续进行去水合检测，每次检测时取一微升溶液点于薄层色谱板上，直至检测结果呈阴性。用2%乙醇无水溶液喷洒薄层板，然后在加热板上90摄氏度加热一分钟。

当不再出现蓝色时，表明已达到终点。接下来，将溶液通过烧结玻璃漏斗过滤至试管中。在负80摄氏度下冷冻溶液，然后转移至冻干机进行冷冻干燥。

将残留物溶于最小量的甲醇中，并通过加入预冷至-20摄氏度的无水丙酮使产物沉淀。通过玻璃砂漏斗过滤收集沉淀的L-A-E-M-A。将漏斗及沉淀物转移至真空干燥器中干燥，首先将约150目的氧化铝纳米颗粒0.5克加入2毫升离心管中的商品级HEAA 1毫升中。

将离心管在300 × g条件下离心30秒，并小心取上层液体作为无抑制剂的HEAA。准确溶解32.8毫克L-A-E-M-A、1.7毫克a EMA、27.5微升无抑制剂的HEAA以及0.4毫升去离子水，并将该溶液转移至一支清洗干净的1毫升锥形管中。接着，向管中加入50微升RAFT试剂和50微升引发剂试剂，通过轻轻敲击管壁（阀门关闭状态下）进行混匀。将该管连接至真空管线，并使用干冰乙醇浴冷冻管内内容物。

然后用泵将管内压力降低至约50毫托，并关闭阀门。移除干冰浴，使内容物解冻。再小心重复两次冷冻、抽真空和解冻的循环。

检查试管，确保内容物已完全溶解，必要时轻轻涡旋。安装前，将密闭的试管从真空管线中取出，放入透明的塑料真空袋中。使用塑料手动泵将袋内空气抽空。

然后将袋子放入70摄氏度的带盖水浴中孵育24小时。接着从袋子中取出试管，将其内容物转移至截留分子量为3,500道尔顿的透析袋中。将透析袋放入烧杯内，用两升去离子水透析24小时。

将透析袋中的内容物转移至离心管中，并置于负80摄氏度的冷冻器中冷冻。待完全冻结后，转移至冷冻干燥机中进行冻干。为获得蓬松的白色糖聚合物PMA LA EMA，首先将5毫克PMA LA EMA溶解于0.9毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成溶液。

接下来，将0.6毫克羧基荧光素辛二酸亚胺酯溶于100微升二甲基甲酰胺中，缓慢加入到快速搅拌的溶液中，置于微量离心管内并用铝箔包裹，室温下缓慢搅拌16小时。将溶液转移至截留分子量为3,500道尔顿的透析袋中。将透析袋放入烧杯内，避光条件下用2升去离子水透析16小时。将透析袋中的内容物转移至试管中。

将溶液在负80摄氏度下冷冻后，进行冷冻干燥。为获得蓬松的黄色荧光标记的P-M-A-L-A-E-M-A糖聚合物，需使用高效液相色谱系统测定该糖聚合物的数均分子量、重均分子量及分散度。首先，在离心管中向50微升红细胞凝集素修饰的磁珠悬浮液加入1.5毫升磷酸盐缓冲液。

然后以300 × g离心试管1分钟。接着弃去上清液，并重复洗涤两次，最后加入0.5毫升PBS。向含有凝集素包被微珠的试管中加入6微升PBS中含3微克荧光素标记的PMA LA EMA溶液。

使用荧光素标记的 P-M-A-G-A-E-M-A 作为阴性对照。接着，用铝箔将离心管包裹，并在室温下孵育一小时。离心一分钟后，弃去上清液。

然后，将珠子重悬于1.5毫升新鲜PBS中，重复洗涤三次。最后，将珠子重悬于0.2毫升PBS中，取4微升悬浮珠子加入免疫荧光显微镜载玻片的孔中，并加盖盖玻片后记录。

使用配备10倍物镜FITC滤光片和相机的荧光显微镜拍摄的载玻片图像。通过凝胶渗透色谱法分析糖聚合物。未使用RAFT合成的聚合物比使用RAFT合成的聚合物具有更高的分散度。

用荧光素标记后，该糖聚合物的外观从白色变为在紫外光下呈现明显的黄色。未标记聚合物的溶液保持暗色，而荧光素标记的聚合物则发出明亮的绿色荧光，证实了标记的存在。只有携带悬垂糖残基的聚合物才会特异性结合到凝集素包被的微珠上，结合后微珠呈现绿色荧光，而用不含悬垂糖残基的聚合物处理时，微珠则保持暗色。这种基于筏状结构的聚合技术使得可合成的糖聚合物类型具有极大的灵活性。

随后还可使用多种荧光试剂对糖聚合物进行标记，这些试剂能够在水性环境中与伯胺发生反应。从事糖生物学研究的科研人员可利用该技术快速获得高度多样化且结构明确的糖聚合物。这些糖聚合物可作为研究工具，用于探索碳水化合物的结合特异性，例如在囊性纤维化患者呼吸道中观察到的结合特性，或在多种人类癌症中涉及的结合特性。