利用啮齿类动物急性海马脑片研究突触标记/捕获及交叉捕获

本实验的总体目标是利用啮齿类动物的Q型海马脑片，研究CA1区锥体神经元中的长时程可塑性及其相关联的机制，例如突触标记、捕获以及交叉标记现象。该目标通过以下步骤实现：首先解剖大脑，并迅速将海马组织分离至冰冷的含氧人工脑脊液中；第二步是使用手动组织切片机制备急性海马脑片，并将其置于界面式孵育室中孵育。

接下来，在CA1区放置两对刺激电极和记录电极，用于记录来自两个突触输入的场兴奋性突触后电位（fEPSP）和群体峰电位反应。最后一步是在特定时间窗口内，诱导其中一个突触输入产生短暂形式的可塑性，而在另一个输入中诱导持久形式的可塑性。最终，长时间记录来自两个输入的场兴奋性突触后电位反应，以研究突触标记捕获和交叉捕获机制。

突触标记与捕获为特定时间范围内短时记忆如何转化为长时记忆提供了理论基础。由于该实验方法涉及对多个突触输入的刺激与记录，学习难度较高，因此对该方法进行可视化演示至关重要。本次实验操作将由我实验室的研究生 Mahesh Shira、Machete 和 Maima Sharma 进行示范。

开始此操作时，准备人工脑脊液（aCSF）并用95%氧气和5%二氧化碳混合气体饱和。将蒸馏水注入界面式孵育槽底部，至其容量的约70%。然后开启温度控制器，并预设为32摄氏度。

接下来，通过进液管以高流速通入蒸馏水 10 至 15 分钟，清洗上室，然后切换至以每分钟 1 毫升流速灌注人工脑脊液（A CSF）。随后在上室中放置一张网，为脑片提供一个静置表面。启动下室的碳合气（carbogen）通气，并将进液管浸入持续通碳合气的人工脑脊液（A CSF）中。

让人工脑脊液（A CSF）与碳合气平衡并充满上层 chamber，需时约 20 分钟。在此步骤中，将剃须刀片安装到组织切片机上，并确保切割刃边缘对齐均匀。通过切割一小片滤纸进行测试，以确认刀片已牢固固定。

然后将滑动游标千分尺调至起始位置。取一只已处死的大鼠头部，使用虹膜剪在后颅骨处剪开，以去除脑干。接着在颅骨右侧做一小切口，在左侧做一较长切口。

从颅骨左侧开始，使用骨钳向右侧小心移除颅骨。为暴露大脑皮层及其表面覆盖的薄层硬脑膜，需用细刮匙小心剥离硬脑膜，随后连同颅骨一并移除额骨骨板。接着，使用刮匙的平头端特别清除大脑皮层与小脑交界处残留的硬脑膜，操作过程中应保持向上施力，避免损伤脑组织。

使用解剖刀轻轻将脑组织舀入置于充满冰冷且含碳酸盐的aCSF的铝制冷却块上的培养皿中，以分离海马体。使用11号手术刀，先做一垂直切口以去除小脑，再做另一切口以去除脑前部的四分之一。然后沿中线做一浅的矢状切口，从中线开始。

使用镰状刻刀小心地去除皮层，以暴露背侧海马体。随后，去除海马体上方的皮层组织。在海马连合处做一小切口。

使用弯头刮匙从背侧开始，以滚动动作轻柔地取出海马体。随后，用弯头刮匙的弯曲端去除分离出的海马体周围的皮层组织和结缔组织。为切片海马组织，将一片浸有脑脊液的30毫米沃特曼滤纸放置在手动切片器的切片台上。

将海马组织转移至滤纸上。使用弯月形手术刀的平端移动滤纸，使海马相对于切片机刀片处于适当的方向，以便海马以约70度的角度相对于fia进行切片。接着，吸去海马组织周围多余的溶液。

使用折叠的滤纸横向切取海马体，并弃去海马体末端切片形态不清晰的部分组织。随后，每次切割后调节游标千分尺，将剩余组织切成400微米厚的切片。每次切割后，用软毛刷轻轻将切片从刀片上转移至盛有冷碳酸化人工脑脊液（A CSF）的小烧杯中。

然后使用干净的塑料移液管将切片轻轻转移至切片孵育室的网架上。用宽口移液管小心调整切片的位置，以便于电极定位和记录检测，确保切片被一层 aCSF 充分包围，但不要完全浸没。随后，盖上孵育室，将切片在突触标记与捕获实验中孵育两到三个小时。

在显微镜下，将两个刺激电极置于CA1区的辐射层（stratum radiatum），以刺激Schaffer侧支纤维，同时将记录电极置于CA1区顶树突区域，位于两个刺激电极之间的中点位置。为记录F-E-P-S-P反应，另将一个记录电极置于锥体细胞层（stratum pyramidale）的颗粒下层（stratum oriens）以记录群体峰电位。

当所有电极均接触脑片后，施加测试性刺激，以确认两个输入通路均能获得良好的场兴奋性突触后电位（fEPSP）信号。一旦获得理想的fEPSP信号，使用操纵器的微调旋钮，小心地将电极再下降约200微米。随后让脑片恢复20分钟。

随后，通过测量场兴奋性突触后电位（fEPSP）在20微安至100微安范围内的不同电流强度下的斜率，确定输入-输出关系。然后，针对每个输入通路，将诱发最大fEPSP斜率40%的刺激强度设定为整个实验过程中恒定的刺激参数。在稳定15至20分钟后，开始记录基线，至少获得30至60分钟稳定基线数据，随后在一个输入通路上诱导长时程增强（LTP）或长时程抑制（LTD）。在该通路中，使用弱四脉冲刺激协议诱导早期LTP，该协议包含一次高频刺激。

在另一输入通道持续记录早期长时程增强（LTP）诱导后30分钟的基线的同时，对输入通路S2使用强直刺激方案诱导晚期LTP，该方案包括重复的高频刺激，串间间隔为10分钟。随后延长记录场兴奋性突触后电位（fEPSP）反应的时间，以揭示突触标记与捕获机制如何将输入通路S1中的早期LTP转化为晚期LTP。类似地，在交叉捕获实验中，首先在一个输入通路诱导早期LTP，30分钟后在另一输入通路使用强低频刺激方案诱导晚期长时程抑制（LTD），该方案由持续15分钟的900次脉冲串组成。

然后长时间记录场EPSP反应，以揭示通过交叉捕获将通路S1的早期LTP转化为晚期LTP的过程。在此示意图中，将两个刺激电极置于CA1区辐射层，以刺激两个独立但存在重叠的突触输入。在CA1区锥体神经元上放置两个细胞外记录电极。

一个用于记录来自顶端树突区室的F-E-P-S-P，另一个用于记录来自参数细胞体的胞体群体峰电位，这些细胞体分别位于辐射层和参数层。该图显示了研究突触标记与捕获的强范式前的一周。

对通路一施加弱四联刺激以诱导早期长时程增强（LTP），30分钟后对通路二施加强四联刺激以诱导晚期LTP。该图显示了在强刺激范式之前的实验设计，用于研究交叉标记。早期LTP通过在通路一施加弱四联刺激诱导，随后在通路二使用强低频刺激方案诱导晚期长时程抑制（LTD）。30分钟后，在通路一中，早期LTP转化为持续六小时的晚期LTP，表明发生了交叉标记与捕获。

一旦掌握，这种解剖和切片制备技术可在三到五分钟内快速完成，从而能够长期保持切片的活性，适用于长时间记录。利用该方法，还可以检测不同药理学试剂对突触标记与捕获过程的影响。

观看本视频后，您应能够充分理解如何开展长期功能性可塑性实验，以及突触标记与捕获的过程。