在小型循环灌流浸没式切片记录系统中记录急性海马脑片的突触可塑性

本实验的总体目标是提供一种简化小体积循环人工脑脊液（ACSF）碳合过程的方法，并通过将记录室安装在荧光显微镜上，实现脑片场电位的长期记录。该方法有助于解答神经可塑性领域中的关键科学问题，特别是与细胞水平的学习和记忆过程中调节突触传递及记忆形成的潜在信号通路相关的问题。该技术的主要优势在于能够稳定小体积生物储液中的氧含量，从而提高使用特定拮抗剂或激动剂进行实验时的成本效益。

本实验由本实验室的博士研究生 Xia 和 Weiguang 演示急性海马脑片的制备过程。开始操作时，使用低温手术刀沿每个半球背侧边缘以 70 度角切下一块背侧皮层组织。用低温牙科水泥铲将每个半球转移至一片滤纸上，短暂干燥表面。

使用速干型粘合胶将两个具有新鲜切面的半脑固定在冰冷的切片平台上，使半脑的尾端朝向剃刀刀片。接着，将切片平台放入振动切片机的冷却室中。向 chamber 内加入 2 至 4 摄氏度的切片缓冲液，并通入碳氧混合气体进行碳酸化处理。

随后，使用合适的振动切片机参数切割出 350 微米厚的脑片。利用两根注射套管作为剪刀，将海马结构从下托和内嗅皮层中分离出来。用巴氏吸管除去预先准备好的孵育 chamber 中切片存放网架上的气泡。

然后，用宽口巴斯德移液管将锥体细胞层具有一定透明度的脑片从切片平台转移至孵育室的网格上。在此步骤中，将三通管连接器连接到循环系统的出流端，将三通管连接器的中臂连接至碳酰气供应管，并使用气流计调节气体流速。

然后，将第二个三通管接头连接到回收系统的进流端。将中间支臂连接至朝向管式加热器的导管，上支臂连接至一段细硅胶管，下支臂连接至来自储液槽的进流管。接着，将一个导管压夹置于细硅胶管上，位置应选择在灌流泵引起的脑片室中人工脑脊液（ACSF）脉动最小的管段处。

现在，将一小片擦镜纸和固定在U形铂金丝上的尼龙网在浸没式切片室中预浸泡几分钟。随后，取出U形铂金丝。关闭循环，将一片组织切片放置在擦镜纸上。

然后，立即将承载切片的网格置于切片上方。打开泵，让切片在不将物镜浸入ACSF的情况下平衡30分钟。在此期间，用ACSF填充记录电极，并将其安装到移液管持夹中。

通过将金属刺激电极放入碳酸氢钠溶液中检测其绝缘性。将电极连接至直流电压发生器的负极，并在解剖显微镜下观察电极尖端气泡的形成。随后，将已测试的环氧绝缘钨刺激电极置于操纵器支架中，并将参考电极丝放入切片室。

向腔室中添加第二个参比电极，并将其连接到记录电极头级的参考插座。在放大器控制软件中，单击零钳制模式复选框，然后双击输出增益列表框。选择增益为100，双击高通滤波器设置框，选择3 kHz，再双击低通滤波器AC列表框，选择0.1 Hz。

在记录软件中，点击采集，打开协议。选择一个具有以下设置的协议：允许进行 episodic 刺激，并以每秒 10 至 20 千赫兹的采样率对放大后的电位进行 50 至 100 毫秒的数字化记录，且在 episodic 记录开始后 10 毫秒自动触发刺激隔离器。将刺激电极和记录电极平行并排地放置于锥体细胞层（stratum pyramidal）上。

随后，点击“采集”按钮，编辑协议，并在弹出窗口中选择“触发”选项卡。点击触发源框，选择空格键作为触发源。然后，点击“确定”按钮，并点击“录制”按钮以开始数据采集。

在刺激隔离器软件中，单击电压控制框并输入零。单击下载按钮。随后，单击记录软件窗口并按下空格键。

依次输入从1000到8000的数值，重复此循环。将刺激强度与FEPSP斜率值进行关联，并确定获得FEPSP斜率最大值40%所需的刺激强度。点击电压控制框，并输入确定的数值。

然后，点击下载按钮。在录制软件中，点击停止按钮，然后点击采集菜单。点击编辑协议，并在弹出窗口中选择触发器选项卡。

随后，单击触发源框，并选择内部定时器作为触发源。单击“确定”按钮，然后单击“记录”按钮，以开始每 60 秒自动记录一次场电位。在 30 至 60 分钟后，单击“停止”按钮。

在记录软件中，点击“采集”，打开协议，选择与基线记录相同的协议。点击“确定”按钮，然后点击“记录”。持续自动运行场电位记录 2 至 4 小时。

当记录完成后，点击停止按钮以终止记录。该图展示了使用流出式碳合气体充气和储液罐碳合气体充气并循环小体积人工脑脊液（ACSF）储液罐时，突触传递的活动依赖性长时程增强的代表性记录结果。在时间零点之后，通过三组每秒100赫兹的电刺激串诱导出长时程增强效应。

该图显示，与仅对储液槽进行碳合气体饱和相比，通过循环小体积人工脑脊液（ACSF）储液槽实现流出液的碳合气体饱和，可改善长时程抑制（LTD）的诱导效果。一旦掌握该技术，脑片制备可在5至10分钟内完成，若操作得当，可实现持续数小时的稳定场电位记录。在尝试该操作时，重要的是需调节碳合气体饱和程度、灌流速度、电极位置以及刺激强度至适合您实验系统的特定条件。

完成该操作后，还可采用其他方法，如膜片钳技术、法医显微技术，以回答更多科学问题，例如在活动依赖性突触可塑性诱导条件下，Ravin探针在单个细胞内的定位变化。该技术建立后，为神经可塑性领域的研究人员提供了探索活动依赖性突触可塑性的途径，使其能够在体外培养的海马脑片中，利用野生型及转基因小鼠基因，将突触可塑性作为学习与记忆的细胞机制进行研究。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从颞叶海马区制备急性脑片，以及如何利用少量循环使用的人工脑脊液（ACSF），实现突触传递长期记录的稳定条件。

请注意，操作动物和化学化合物可能存在危险，因此在进行本实验时，必须采取佩戴手套和适当消毒等预防措施。