兔心Langendorff灌注模型中肌浆网内Ca²⁺及跨膜电位的光学标测

本实验的总体目标是在完整离体LOR灌注兔心中，同时光学成像肌浆网内游离钙离子浓度和跨膜电位。该目标通过以下步骤实现：首先取出兔心，并将主动脉插管以进行逆向兰诺灌注；第二步是在灌注液中加入兴奋-收缩解偶联剂以消除心脏收缩。

接下来，将灌注切换至小体积循环回路，并在室温下加入低亲和力钙指示剂。最后步骤是使用大体积灌注回路将心脏升温至37摄氏度，并加入膜电位敏感染料。因此，在实验过程中，通过蓝光激发心脏并利用高速CMOS相机检测发射光，来同步测量钙离子浓度和跨膜电位的变化。

该技术相较于现有方法的主要优势在于，它允许研究人员直接检测肌浆网（SR）中短暂的钙动力学变化，而不会受到跨膜钙信号的干扰。该方法还有助于回答与肌浆网钙处理在心律失常发生中作用相关的关键问题，因为跨膜电位与肌浆网钙信号可被同时记录。通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为光学检测的肌浆网钙信号幅度非常低。因此，钙指示剂的正确加载至关重要。在本方案中，必须预先准备好新鲜配制的台氏液。

四升即足够。切勿在未稀释的情况下混合浓缩储备液。同时，应按照文本方案中的指示提前配制好其他溶液，并用95%氧气和5%二氧化碳混合气体对酪氨酸溶液进行通气，调节气体流速，使溶液的pH值接近7.4。

溶液应处于室温。通过安装一个孔径为11微米的尼龙在线滤器以过滤灌注液，来准备循环L和orf灌注系统。现在用约两升的氧合酪氨酸溶液预冲主灌注系统。

总体积为两升，包括储液器中的溶液。接下来，准备并预充一段短的灌注管路，该管路绕过溶液储液器，以建立一个用于Fluo-5N AM的小体积循环灌注回路。较小循环系统中的总体积应约为150毫升。

准备压力监测系统时，将压力传感器连接至灌注管路，并将传感器的输出端连接至跨桥放大器。随后启动数据采集系统，将其设置为持续监测心电图（ECG）和灌注压力。

接下来，将基线灌注压调整至零毫米汞柱。最后，按照文本方案中所述方法校准光学标测相机。首先，固定兔子，并使用戊巴比妥进行麻醉，同时给予1000单位的肝素推注。

用双手遮住兔眼以使其镇静。使用钝头剪刀沿正中线切开，暴露胸骨和肋骨。在剑突与胸骨之间剪断胸骨。

接下来，小心地打开胸骨，避免损伤心脏，并撑开肋骨以暴露心脏。然后迅速切断所有周围血管和组织，完整取出心肺组织块。将心肺组织块转移至约100毫升冰冷的台氏液中。

在切除的组织块中，找到主动脉，并在主动脉弓三个分支近端处切断升主动脉。然后将连接灌注系统的8号套管插入主动脉，并用一段USP 0号丝线将主动脉固定在套管上。

固定套管后，仔细分离气管、肺脏和心外膜脂肪。接着，辨认二尖瓣，并使用锐利的镊子和剪刀小心地损伤或切除一个瓣叶。这样可防止左心室内的溶液淤积。

继续将心脏水平放入灌注腔中，使前面朝上。将套管放置在一块沙丁鱼上。用U形针穿过沙丁鱼块并插入灌注皿的硅胶底部，以固定套管。

这将防止心脏移动。成像过程中，如有需要，可使用一根细小的昆虫针固定心尖，测量灌注过程中所用台氏液的量，并补充新鲜溶液，以保持循环溶液总量为两升。现在将心电图电极完全浸入心脏两侧的浴液中，但不要与心脏接触。

然后验证此操作是否形成正常的I导联心电图波形。同时，通过将灌注流速调节在每分钟25至35毫升之间，维持主动脉压力在60至70毫米汞柱。现在，关闭室内灯光，并向PERFU八中加入0.3至0.6毫升的BLEs他汀储备液，使其终浓度达到10至20微摩尔。

10 到 15 分钟后，心脏收缩应停止。然后切换到小体积灌流系统。成功进行肌浆网钙成像的关键之一是正确加载 Fluo-5N AM 染料。

这需要使用小体积灌注以实现高染料浓度和室温条件。为避免细胞质中的 D 发生 D 去酯化反应，现配制 500 µL fluo-5N AM 负载溶液，并将其与 500 µL 罗丹明溶液混合，然后加入 PERFU 八中。

让下载持续进行45分钟，然后打开循环水浴，将系统升温至37摄氏度。下载一小时后，切换回较大量体积的Perfu eight。接着，将50微升电压敏感性染料RH 237加入1毫升温热的tyros中并混匀。

在大约五分钟内缓慢将此溶液注入系统，随后进行心脏光学标测。开始时，将光学标测相机对准适当视野，以减少PERFU八表面的运动。将盖玻片轻轻漂浮于溶液表面。

现在调整LED光束，以对心脏提供均匀照明。每次光学记录时，设置所需的起搏程序。打开激发光源，并在1至2小时内采集1至4秒的数据。

染料泄漏产生的噪音将终止实验。随后用去离子水冲洗系统，接着用70%乙醇冲洗，最后再用去离子水冲洗一次。

利用所述方案，可分离跨膜电位信号与肌浆网（SR）钙信号的光谱。在连续起搏期间的光学信号迹线也被记录下来。随后通过绘制每个像素的激活时间，由数据构建出激活图谱。

在等时图上，两个信号之间通常存在 8 到 10 毫秒的延迟。可通过不同起搏周期定量分析舒张期肌浆网钙负荷和收缩期肌浆网钙释放幅度的相对变化。应用β-肾上腺素能受体激动剂异丙肾上腺素后，观察到病理性的肌浆网钙处理异常。

红色箭头指出了肌浆网中明显的钙泄漏。在这种条件下，可能发生由钙介导的动作电位触发。观看本视频后，您应能够清楚了解如何在完整兔心的朗格多夫灌流心脏中同时进行跨膜电位和肌浆网钙信号的光学标测。