小鼠心脏动作电位与钙瞬变的光学标测

本实验的总体目标是对完整分离的经LOR灌注的小鼠心脏，同时进行跨膜电位和细胞内钙瞬变的光学标测。首先取出完整的小鼠心脏，随后将主动脉插管并开始LOR灌注。下一步是通过加载兴奋-收缩耦联剂使心脏固定，然后将心脏固定于灌流室中。

最后的步骤是加载光学染料，并做好准备以减少实验过程中的运动伪影。光学图像通过使用 my cam Ultima LC Moss 相机采集心脏发出的光获得。嘿，我叫 di。

我是华盛顿大学的一名研究生。与现有方法（如微电极）相比，该技术的主要优势在于光学标测能够实现对心脏整个表面更高空间分辨率的观测。大家好，我是Matt Sulkin。

我是华盛顿大学的研究生。如果操作得当，该方法可帮助解答心脏电生理学中的诸多问题，例如心律失常的发生机制。首先将一台蠕动泵设置为以每分钟40毫升的速度循环溶液。

然后将第二个蠕动泵设置为 80 毫升每分钟。该泵将灌注液八回输至储存和氧合储液器中。开启泵，以一升 70% 乙醇进行循环冲洗系统 30 分钟。

用两升去离子水冲洗，不进行循环。排空水后，循环两升Tyro溶液，并使其通过一个五微米滤器。使用水套将灌注液加热至37摄氏度，并将含氧气体以气泡形式通入溶液中。

调节气体冒泡速率，使 pH 值维持在 7.35 ± 0.05 范围内。实验过程中需持续监测 pH 值和温度。双光学标测装置由两台高速 CMOS 相机组成，可每秒捕获 3000 帧、100 × 100 像素的图像。

将带通滤光片连接到钙成像相机上，并将长通滤光片连接到双相机支架上的电压成像相机上。安装二向色镜和透镜，使来自心脏的发射光经透镜聚焦后投射到二向色镜上。同时，将两台相机安装到支架上，并调整位置使其相互垂直。

接下来，设置激发光源。光源由卤素灯产生，并通过柔性导光管引导。让光线依次通过热滤光片、用于控制曝光的快门以及激发光带通滤光片。

最后，通过将银和氯化银电极安装到腔室中来制备电极。仔细检查并调整放大器和滤波器的信号水平后，该装置即可用于心脏实验。在进行下一步操作前，使用含有100单位肝素的氯胺酮和赛拉嗪混合物对小鼠进行麻醉。

通过脚趾夹捏确认动物无疼痛反射。沿胸骨中线做切口后，迅速取出心脏及周围组织。然后在解剖显微镜下快速识别主动脉，并在右锁骨下动脉下方的升主动脉处做一整齐切割。

现在，使用四根0号黑色编织丝线将一小段主动脉连接到自制的21号套管上。插管后，逆行灌注并持续灌流心脏。用Tyrode液调节流速，通过压力传感器监测，使主动脉压力维持在60至80毫米汞柱之间。

现在解剖并去除周围的肺、胸腺及脂肪组织。接着通过肺静脉将一根硅胶管插入左心室。将导管缝合固定于附近的结缔组织上。

这一非常重要的步骤可防止灌注液八在左心室滞留引起的充血和酸化，尤其是在心室收缩被抑制后。为防止灌注液八引起的心脏运动，需将心脏的心尖部固定在涂有硅胶的灌流室底部。此外，应拉伸并固定右心耳和左心耳，以增加直立状态下心房的表面积。

这将最大化记录表面积。进行起搏刺激时，将自制电极连接到心脏表面。为减少运动伪影，在溶液表面的心脏上方固定一小块盖玻片。

通过将玻璃片夹在多个固定针之间来固定。最后的准备工作包括：将激发光聚焦于心脏，并调整相机位置以获取光学图像，随后在加载染料的同时开始染色。持续监测心电图记录，以确保心脏的正常电生理功能。

首先将BLEs他汀预热至室温。然后将0.5毫升的BLEs他汀加入灌注系统储液罐中的大量Tyros溶液中，并将剩余的0.1毫升BLEs他汀稀释于1毫升Tyros溶液中。在接下来的20分钟内，通过靠近套管的给药口将BLEs他汀的Tyros溶液缓慢注入。

BLEs 类他汀将逐渐减少运动伪影。接下来，将30微升电压敏感染料稀释至1毫升台氏液中，并在5至7分钟内缓慢通过同一给药端口注入该混合液。然后再次配制相同的混合液。

此次加入额外的30 µL钙离子指示剂。通过同一通道在5至10分钟内缓慢加入该混合液。钙离子指示剂注射后，需再等待5至10分钟，使BLEs他汀充分抑制运动，并让染料完全进入细胞，然后再继续实验。

制备了该心脏标本。根据实验方案，在心室起搏期间记录了从S1到S1刺激的ECG信号。同时从左侧心房和右侧心室记录了动作电位和钙瞬变信号。

箭头指示了通过将相机记录的信号以 3 像素 × 3 像素为单位进行像素合并后，心室信号散射发生的位置，从而可根据阵列数据展示一系列钙瞬变和动作电位。可据此构建显示动作电位传导的图示。来自横轴和纵轴上三个连续点的数据展示了动作电位在心室表面传播过程中振幅的变化。

同样，可以构建显示动作电位和钙瞬变持续时间的图。左侧显示对照条件，右侧显示处理条件。向心脏注射了异丙肾上腺素，明显缩短了钙瞬变和动作电位的持续时间。

掌握该技术后，按照本方案可在两到三小时内完成操作。此外，还可采用其他方法（如起搏方案）来回答更多问题，例如有关房室结不应期的问题。