体外 生理与病理血流模型及其在血管细胞重塑研究中的应用

以下实验的总体目标是观察不同脉动血流病理状态对内皮细胞的影响（体外实验）。首先通过化学方法处理玻片，并在玻片表面包被蛋白质，以确保细胞在受到流体剪切力作用时能够牢固贴附。

第二步是测定流体的搏动性指数，以便将体外流动条件与文献中描述的数值进行比较。随后将接种有细胞的载玻片连接至流动系统，以测量细胞对不同流动病理状态的响应。结果显示，通过光学显微镜和免疫荧光染色检测，细胞形态和蛋白质表达随流动模式的不同而发生变化。

与蠕动泵或脉动泵相比，该技术的主要优势在于能够调节流动脉动性，以模拟疾病状态或健康状态下的生理响应。这有助于解答动脉疾病领域中的关键问题。首先，将尺寸为75毫米×50毫米×1毫米的全新玻璃载玻片放入洁净的玻璃载玻片染色皿中。

然后加入足量的20%硫酸溶液，完全浸没载玻片，并在酸溶液中孵育过夜。次日，用去离子水将载玻片浸泡清洗三次，每次五分钟。清洗完毕后，将载玻片浸入丙酮中30分钟，随后在含有6%三氨基丙基三乙氧基硅烷的丙酮溶液中过夜孵育。

接下来，将载玻片在纯丙酮中清洗三次，每次五分钟，每次清洗后更换丙酮。然后用去离子水清洗载玻片三次，每次五分钟，每次清洗后更换去离子水。接着将载玻片浸入1.5%戊二醛溶液中，浸泡60分钟。

交联后，用去离子水将玻片清洗两次，每次清洗后更换去离子水，然后将玻片放入70%乙醇中30分钟以进行消毒。去除乙醇，并让残留液体在玻片上自然挥发。待玻片干燥后，将其短暂浸入无菌去离子水中以重新水化。

接下来，取下滑片架并将其放入一个 100 毫米 × 100 毫米的方形培养皿中。在超净工作台内，将 1 毫升浓度为 25 微克/毫升的纤连蛋白溶液均匀覆盖在功能化滑片表面，覆盖范围应大致与细胞培养腔接触的区域相同。然后盖上培养皿，在 37°C 条件下孵育 1 至 2 小时。孵育结束后，吸除残留溶液，并将 600,000 个内皮细胞悬浮于 1 毫升含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中，接种至滑片的包被面。

盖上培养 chamber，然后在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下孵育细胞 120 分钟。随后用额外的培养基覆盖细胞，并继续孵育至细胞融合度达到 70% 至 80%。按照随附文本方案中所述并如图所示连接流路，确保阻尼 chamber 和超声波流量计按正确的流动方向排列。

接下来，用去离子水填充流路、回路和储液器。确保储液器的出口管浸没在储液器液面以下。然后使用流量计观察流体波形。

打开阻尼室上的空气释放阀，以改变流体与空气的体积比。在不同的液位间隔关闭空气释放阀，并计算搏动指数。计算该指数时，通过评估血流波形，其中峰值代表最大速度（VM max）。

波谷代表 v min，V mean 为信号记录的平均值。将搏动指数值记录在笔记本中。使用毡尖永久性墨水笔在阻尼室上标记出最终的液位和搏动指数，以供后续使用。

在准备流室预热时，参考随附文本方案中引用的病理学文献，确定所需搏动指数水平。使用含1%FBS的DMEM，在37摄氏度水浴中进行操作。当细胞涂覆的载玻片达到70%至80%融合度时，从培养基中取出一张载玻片，并将垫圈放置在细胞附着面的上方。

接下来，将流室的真空通道与垫片上的孔对齐。然后将真空管连接到真空接口上，确保无培养基泄漏至真空系统中。在玻璃载片下方放置一张聚碳酸酯板，并使用一个弹簧夹固定流室组件的每个短边，以及两个弹簧夹固定流室的长边。

接下来，将流室、入口和出口连接到流动回路。将流动系统置于设定为37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱中，并通过向储液器加入培养基并以低脉动方式泵入，使回路充满预温的培养基。维持此流动状态四小时，以对细胞进行预处理。

然后将阻尼室中的液体体积调整至预标记的搏动指数水平，并进行培养。根据所需时间培养细胞。此处展示的内皮细胞分别在无流动、稳定流动和搏动流动条件下进行培养。

暴露于高脉动血流24小时后，细胞形态可能从典型的内皮细胞形态转变为更接近纺锤形的形态，而静态和稳态血流条件下细胞形态则几乎没有变化。如图中所示，通过α-平滑肌肌动蛋白和肌球蛋白重链的不同表达水平可以发现，与暴露于高脉动血流的内皮细胞共培养也会影响平滑肌细胞。

在不同的流动条件下，暴露于脉动流的细胞中这两种蛋白的表达量最高，表明细胞发生了肥大和具有收缩性。在进行该操作时，重要的是注意保持所有密封，并确保操作后液体水平保持恒定。此外，还可采用内皮细胞与血管细胞共培养等其他方法，以回答细胞间相互作用等其他科学问题。

观看本视频后，您应能够充分理解如何组装流体回路、控制指数，以及如何使内皮细胞暴露于脉动流中。