发育与表征 体外 微血管网络及内皮细胞[Ca²⁺]_i 和一氧化氮的产生

本实验的总体目标是开发一种微流控装置，使内皮细胞能够在生理相关的剪切流条件下生长，并测量激动剂诱导的细胞内钙离子和一氧化氮生成的变化。该研究有助于推动微血管研究的未来发展，通过验证体外微血管模型，弥合体内与体外研究之间的差距。该技术的主要优势在于微通道设计灵活，可模拟多种血管结构，同时改善了细胞培养环境，使其比传统的静态培养更接近体内条件。

演示实验操作的是来自我实验室的 Sulei 和 Xiang。开始之前，请按照文本方案中所述，使用标准的光刻技术制备主模板，并通过软光刻技术制备PDMS微通道装置。准备微通道装置时，首先用一小片薄PDMS覆盖入口和出口，然后将装置放入培养皿中，并在皿内放置一张湿润的纸巾。

然后，用封口膜包裹培养皿，并在紫外灯下对装置进行至少三小时的灭菌。下一步是包被纤连蛋白。首先，在入口处加入30至50微升的PBS液滴。

在出口处创建真空以冲洗装置。接着，在入口处加入一滴浓度为100微克/毫升的纤连蛋白溶液。在出口处创建真空，以加载纤连蛋白溶液。

接下来，封闭进样口和出样口。再次用封口膜包裹培养皿，并在 4 摄氏度条件下过夜孵育装置。第二天，用 PBS 手动冲洗装置三次。

然后，加入30至50微升的细胞培养基，并将装置置于37摄氏度的培养箱中预热至少15分钟。开始操作时，将HUVECs以每毫升200万至400万个细胞的密度悬浮于含8%葡聚糖的HUVEC培养基中。添加葡聚糖是为了提高培养基黏度，从而改善细胞接种效果。

接下来，将10至20微升细胞加入入口上方，通过重力作用或在出口处使用玻璃巴斯德吸管利用毛细作用引入细胞。随后，将装置孵育15至20分钟。然后，在显微镜下检查接种情况。

如有必要，可加载更多细胞以达到所需的细胞密度。加载足够细胞后，用正常温度的温热细胞培养基轻轻冲洗装置，以去除葡聚糖。随后，在无培养基灌注的条件下培养装置六小时。

接下来，建立用于长期灌注的管路连接。将装置用胶带固定在培养皿上，然后将入口管路连接到带针头的注射器。将管路插入装置的入口和出口两端。

将出口管路连接至废液收集器。现在，将培养皿和废液容器放入培养箱中。将带有长进液管的注射器连接至穿过培养箱门的外部灌流泵。

然后，根据实验设计设定灌注速率。通过良好控制的灌注，微血管网络中的培养可维持长达两周，因此可将其扩展用于模拟不同生理和病理条件下细胞及血流动力学环境的长期研究。

开始免疫染色（例如 VE-钙黏蛋白标记）时，首先在 4 摄氏度条件下用 2% 多聚甲醛灌注固定细胞 30 分钟。经过一系列灌注步骤以进行封闭、通透化和抗体染色后，将装置置于 4 摄氏度直至成像。为检测细胞内钙离子浓度，需在 37 摄氏度条件下用含 10 毫克/毫升白蛋白的林格氏液灌注装置 15 分钟。

接下来，在37°C条件下，用5 µM Fluo-4 AM对装置灌注40分钟。然后，在37°C条件下，用含白蛋白的林格液冲洗15分钟，以去除管腔内结合的Fluo-4 AM。接着，启动共聚焦成像系统，利用Fluo-4 AM进行细胞间钙离子水平的成像。采集加载Fluo-4的微血管图像。

采集10分钟的基础图像。随后，用10 µM ATP持续灌注装置，并记录20分钟内的荧光强度变化。为观察细胞中一氧化氮的生成，需在37 °C条件下用牛血清白蛋白林格液灌注装置15分钟。

然后，在37摄氏度下用5微摩尔DAF-2 DA对细胞灌注约35至40分钟。接着，设置荧光成像系统以检测ATP诱导的一氧化氮生成。记录5分钟的基础值，随后用10微摩尔ATP灌注装置，并以每分钟一次的间隔采集30分钟的图像。

在进行细胞一氧化氮检测时，需要明确的是，强度分布图中的脱离适配器反映的是随时间累积的一氧化氮生成量，而非一氧化氮浓度。应从采集的图像中手动选择感兴趣区域，以单个细胞为单位进行分析。每个感兴趣区域（ROI）覆盖单个细胞的范围，该范围可通过荧光轮廓来标示。

通过计算Fluo-4荧光强度的变化（减去组织背景），定量分析ATP诱导的内皮细胞内钙离子变化；通过检测DAF-2荧光强度随时间的一阶微分转换，定量分析一氧化氮的生成速率。

该装置中的微通道图案具有三级分支网络。通过三维数值模拟，估算了在0.35微升/分钟流速下的剪切应力分布。内皮细胞按所述方法接种至该网络中。

然后，对F-actin和细胞核进行标记。同样，也对VE-钙黏蛋白进行了染色。结果与完整微静脉中VE-钙黏蛋白的表达相似。

接下来，检测了ATP诱导的细胞内钙离子水平升高和一氧化氮生成。钙离子水平的检测采用Fluo-4 AM，方法见方案部分。一氧化氮生成的监测采用DAF-2 DA，方法见方案部分。

结果与使用单独灌注的完整微静脉所得结果相当。该技术在生物条件和动态流体环境中的操作简便且控制严密，这是传统显微操作技术无法实现的。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备该装置，并进行钙离子和一氧化氮的检测。

该技术为研究人员开辟了道路，不仅可用于研究激动剂诱导的潜在机制，还可拓展其在生物医学研究中的更广泛应用。