结肠干细胞突变的定量分析

本实验的总体目标是定量分析结肠干细胞中葡萄糖六磷酸脱氢酶（glucose six phosphate dehydrogenase，G six PD）基因的表型体细胞突变。在用潜在的遗传毒性物质处理动物后，首先给予动物相应处理剂，并等待适当时间，使携带 G six PD 基因突变的干细胞子代完全占据整个隐窝，随后处死动物，取出结肠组织，将其卷成瑞士卷状，并在液氮中速冻保存。第二步是使用冷冻切片机将结肠组织制成七微米厚的冷冻切片，并贴附于载玻片上。

将组织升温至37摄氏度，然后在组织切片周围构建每份组织染色的染色孔。最后一步是将组织切片与G六PD染色液孵育，随后在光学显微镜下分析切片：具有G六PD活性的细胞呈蓝色，而具有表型突变的细胞则呈淡白色。最终通过定量突变型克隆来确定突变频率。

该技术用于检测干细胞中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的体细胞突变，而干细胞是结肠癌发生过程中关键的细胞群体。通过鉴定体细胞干细胞中的突变，可以将突变频率与经处理动物的结肠癌发生率进行关联分析。尽管该方法可用于研究结肠中干细胞的突变情况，也可应用于其他模式生物或器官系统。

如果能够确定干细胞微环境，通常初次接触该方法的人员在制备MBT溶液时会遇到困难。MBT溶液的溶解过程需要严格遵循详细的说明。开始制备组织学染色溶液时，需在50毫升离心管中加入2毫升pH 7.4的磷酸盐缓冲液和35毫升最佳切割温度包埋剂（OCT介质），然后剧烈振荡，并使用pH试纸检测以确保充分混匀。

确认溶液的 pH 值约为 7.4。接下来，按照文本方案中的说明，向葡萄糖-6-磷酸和二磷酸腺苷（ADP）以及溶解于磷酸盐缓冲液中的氯化镁溶液中加入 M-M-P-M-S 溶液，并再次确认溶液的 pH 值仍维持在约 7.4。加入 M-M-P-M-S 溶液后剧烈混匀。

应得到澄清的深红色匀浆，用铝箔包裹溶液以减少光照。如果溶液变浑浊，则应弃去，同时油浴正在加热。另取一2毫升带O形圈盖的离心管，加入0.4毫升二甲基甲酰胺、0.4毫升无水乙醇和MBT（硝基蓝四唑），盖子轻轻拧松，混合配制5毫摩尔的硝基蓝四唑（MBT）溶液，并将该管置于油浴中剧烈煮沸，直至MBT完全溶解。

接下来，将 MBT 溶液冷却至室温，然后加入 OCT 反应混合物中。溶液的颜色可能会随时间从最初的橙红色变为深红色或紫色。在按照文本方案对动物进行处理并制备好冷冻切片后，使用两个钢制垫圈叠加并用硅脂密封，以在垫圈底部形成染色区域；将中心部分切除，用于放置溶液。

在37摄氏度的湿润环境中将冷冻组织切片预孵育10分钟。接着，将小室置于切片上，围绕组织切片区，每个小室加入约0.5毫升预先配制的G6PD染色混合液，孵育45至50分钟。从温箱中取出切片，小心地从切片上移除不锈钢小室。

将切片置于长边，沥干反应混合液，随后用 100 毫摩尔磷酸缓冲液洗涤 30 至 60 分钟。为去除 G6PD 染色液的最后残留，用去离子水冲洗切片 5 至 10 分钟以除去残余的磷酸缓冲液。最后，在切片上滴加氟胶封片剂，逐滴加入并干燥 30 分钟，以获取用于后续分析的图像。

将玻片置于光学显微镜下，调整至4倍物镜放大倍数。然后使用500万像素相机拍摄染色组织切片的图像，以估算所检测的隐窝总数。对每只小鼠，选择表面面积最小水平的一个切片，并在10倍放大倍数下进行成像。

计数突变隐窝的数量。根据以下标准，整个隐窝无蓝色染色，但隐窝的外部结构保持完整。

在相邻的7微米切片上观察突变体，并由两位观察者共同确认同一隐窝为突变体。目视计数该切片中隐窝的数量，并乘以每根结肠所筛查的层面数。在接受DNA损伤剂偶氮甲烷处理的小鼠中观察到的突变隐窝示例如下：左侧显示的是突变隐窝的纵向或自上而下视图。

右侧为水平或侧面视图，要判定一个隐窝为突变隐窝，必须确保隐窝内的所有细胞均保留完整。白色隐窝中带有少量白色是由于杯状细胞产生黏液所致。突变频率的计算方法为：观察到的突变隐窝数量除以筛查的隐窝总数（不含突变隐窝）。

在对照组小鼠的结肠中观察到隐窝，其突变频率低于1×10⁻⁵，而经偶氮甲烷处理的小鼠其干细胞突变频率为4.44×10⁻⁴。按照本实验流程，还可采用其他方法，例如对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变类型进行遗传学分析，以回答更多问题，如化学试剂如何导致错配突变。观看本视频后，您应能够充分理解如何检测经潜在致突变性和致癌性化合物处理后小鼠体细胞干细胞的突变情况。