通过靶向测序方法进行比较性病变分析

本方案通过鉴定疾病进展过程中涉及的分子改变，实现了对原发灶与转移灶之间遗传相关性的捕获。我们的方法能够以高灵敏度和特异性探索临床样本中的遗传相关性，这得益于分子分析与组织病理学分析的整合。

在癌症研究领域，评估肿瘤内异质性对于设计有效的抗肿瘤策略至关重要，而我们的方法可广泛适用于多种实体瘤类型。在完成目标文库的制备与定量后，将每个文库用无核酸酶的水稀释至100皮摩尔浓度，并从每种稀释后的文库中各取10微升，合并至同一管中用于单次运行。随后通过移液混匀合并后的文库。

要启动测序运行，请首先在连接至测序系统的计算机上打开 Torrent 浏览器。使用所选应用的通用模板规划新运行，并在“试剂盒”选项卡中选择 Ion Proton 系统或 Ion Gene Studio S5 系统。从芯片类型下拉菜单中选择合适的芯片，并从文库试剂盒下拉列表中选择 Ion AmpliSeq 2.0 文库试剂盒。

选择模板试剂盒的 Ion Chef 按钮，然后从模板试剂盒下拉列表中选择相应的 Chef 试剂盒。从测序试剂盒下拉菜单中选择相应的测序试剂盒，并从条形码集合下拉列表中选择 Ion Express。在插件选项卡下，选择覆盖度分析插件。

在“计划”选项卡下，从参考基因组下拉列表中选择 GRCH37HG19 基因组。从目标区域下拉列表中，选择要测序的相应面板。然后设置要测序的标签（barcode）数量，并为每个文库设置标签名称和样本名称。

对于文库混合稀释，使用无核酸酶水将文库原液稀释至25皮摩尔浓度（适用于Ion Proton芯片），然后将每种稀释后的文库各取50微升加入相应文库样本管底部。将含有混合稀释文库的样本管装载到文库制备系统上，启动克隆扩增。进行下一代测序时，按照屏幕上的指示初始化仪器。

当克隆扩增完成后，打开 Ion Chef 仪器门，然后打开芯片加载离心机的盖子，从文库制备系统中取出两张芯片。将芯片分别放入独立的芯片储存容器中，并将其中一张芯片装入仪器的芯片仓内。随后关闭芯片仓盖，启动测序程序。

进行突变分析时，打开覆盖度分析插件，利用覆盖度分析结果验证测序深度和覆盖均匀性。使用 Torrent 变异检测插件进行变异 calling，根据需要选择生殖系或体细胞工作流程。然后下载经过过滤的变异位点 VCF 文件，并利用 NCBI RefSeq 数据库中的变异效应预测软件对变异进行注释。

为了估算拷贝数变异，使用 Ion Reporter 上传插件将测序数据导入 Ion Reporter 软件，并采用全面癌症检测 panel 肿瘤-正常配对工作流程分析数据。根据软件赋予的评分，手动筛选突变和拷贝数变异，并通过整合基因组浏览器（Integrative Genomics Viewer）对变异进行可视化验证。随后，目视检查比对结果中可能产生假阳性变异的异常读段，并将特定基因所有扩增子的标准化覆盖度与基线的标准化覆盖度进行比较，以确认拷贝数变异。

针对每个病例，对正常组织、血液、原发性肿瘤或转移灶测序所得的突变调用结果进行索引。若突变在种系DNA测序数据中同样存在，则标记为种系突变并予以剔除。将特定患者所有病灶中均存在的突变标记为克隆性或始祖性突变。

随后，将那些在某一特定患者的某些病灶中被检测到、但并非存在于所有病灶中的突变标记为亚克隆性（subclonal）或进展性（progressor）。在此项代表性实验中，对5例实性假乳头状肿瘤病例的多个病灶进行测序，靶向409个癌症相关基因的编码序列，共鉴定出8个基因中的27个体细胞突变。若某一突变存在于某一特定患者的所有病灶中，则定义为奠基性（founder）或克隆性（clonal）突变；若仅存在于该患者的某些而非全部病灶中，则定义为进展性（progressor）或亚克隆性（subclonal）突变。

一致地，携带相应基因突变病例的不同病灶在β-catenin和KMD6A的免疫组织化学染色中表现出均一性。突变标本中KMD6A呈中等程度染色，提示基因改变可能更倾向于影响蛋白功能而非其表达水平。胰腺肿瘤中KMD6A功能丧失与缺氧标志物GLUT-1的上调相关。

因此，在携带KMD6A突变的病例中，GLUT-1呈过表达。BAP1和TP53的免疫组织化学染色证实，这些基因的突变属于亚克隆性改变。在此例代表性病例的虚拟核型图中，显示了发生改变基因的位置、邻近关系及拷贝数状态，基于测序数据的拷贝数变异分析揭示了所有被分析标本中均存在基因改变。

与点突变相反，大多数拷贝数变异的改变属于亚克隆性事件。对突变和拷贝数变异进行验证与注释，并利用肿瘤组织与正常DNA的比对，对于避免产生可能使结果无效的假阳性检测至关重要。该流程也可应用于全基因组测序研究，旨在全面筛查不同实体瘤类型病灶间的基因组变异以识别突变。

在癌症研究领域，这些技术是理解具有重要临床意义的疾病生物学的关键工具，旨在设计个性化且有效的靶向治疗方案。