利用工程化群体感应淬灭乳糖酶抗毒力破坏致病性生物膜

本实验的总体目标是证明群体感应淬灭酶在细菌生物膜破坏中的有效性。该方法将有助于回答抗菌治疗领域中的关键问题，并帮助理解群体感应淬灭型内酯酶对生物膜环境中致病菌的作用。该技术的主要优势在于，群体感应淬灭内酯酶可直接添加至体外环境中。

因此，其对生物膜破坏的效果可轻松进行定量分析。本实验操作由本实验室技术员 Terrence Tay 演示。首先，在摇床培养箱中，于 30°C 条件下，在 LB 培养基中培养 5 毫升 A.baumannii S1 菌液，培养 16 小时。

将菌液浓度调整至 OD 600 为 0.8。然后用含有 4 mg/mL 纯化 GKL 酶的新鲜 LB 培养基将菌液稀释 100 倍，并取 100 µL 加入 96 孔板的孔中。

用盖子盖住培养板，并将其放入一个10升的塑料容器中。密封容器后，在30摄氏度下孵育3小时，然后轻轻移除培养基。向孔中再加入100微升新鲜LB培养基，并将培养板在30摄氏度下继续孵育21小时。

轻轻移除培养基后，用 200 微升无菌水轻柔冲洗浮游细菌细胞。将移液器枪头置于孔底部，小心吸出液体培养基，以尽量减少对气液界面处生物膜的扰动。然后向每孔中加入 100 微升 1% 结晶紫溶液，在室温下孵育 15 分钟。

用200微升无菌水洗涤各孔三次，以去除结晶紫溶液。每孔加入100微升33%乙酸，轻轻振荡孵育15分钟，使染料溶解。通过测定结晶紫在600纳米处的吸光度来定量生物膜的量。

结晶紫的量与形成的生物膜量成正比。为了对鲍曼不动杆菌S1的生物膜进行共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析，将5毫升鲍曼不动杆菌S1菌液接种于LB培养基中，在30°C摇床培养箱中培养16小时。将鲍曼不动杆菌S1菌液的OD600调整至0.8。

然后用含有每毫升1.2毫克纯化GKL酶的新鲜LB培养基将菌液按1:100稀释，并取1毫升加入35毫米玻璃底培养皿中。用盖子盖好培养皿，放入10升塑料容器内并密封，于30摄氏度孵育3小时。轻轻移除培养基后，加入含30微升纯化GKL酶的新鲜培养基1毫升，再于30摄氏度继续孵育21小时。

再次轻轻移除培养基，并更换为含有1毫升GKL酶的新鲜培养基。在30°C下孵育24小时。孵育结束后，轻轻移除培养基，加入500 µL溶于HBSS中的Alexa Fluor 488标记的小麦胚芽凝集素（5 µg/mL）。

将微皿在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，以染色生物膜。为固定生物膜，加入 500 微升溶于 HBSS 的 3.7% 多聚甲醛，于 37 摄氏度孵育 30 分钟。用 2 毫升 HBSS 洗涤微皿一次，然后完全去除溶液。

在共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像前，将培养皿置于黑暗环境中4°C保存。进行CLSM成像与分析时，使用63倍物镜，每幅图像生成97个焦平面，每个焦平面间隔0.21微米。在结晶紫定量实验中，采用野生型GKL以及一种经过改良的GKL双突变型群体感应淬灭酶，检测其对三种羟基癸酰基高丝氨酸内酯（3OHC10HSL）的乳糖酶活性，3OHC10HSL是鲍曼不动杆菌S1使用的主要群体感应分子。如图所示，这两种酶均能显著减少经预处理的野生型鲍曼不动杆菌S1的生物膜形成。然而，两种酶对生物膜的破坏程度与其针对3OHC10HSL的活性效率并不成正比。

如本表所示，突变型GKL对3OHC10HSL的催化转换速率比野生型GKL快六倍。然而，两种酶在生物膜破坏程度上的差异仅为两倍。本实验中，使用了改良的GKL突变酶及其儿茶酚失活酶进行比较。

该微分干涉相差（DIC）图像显示，与无活性的酶相比，经改良的GKL突变酶处理后，生物膜尺寸减小。荧光图像分析还表明，使用改良的GKL突变酶处理后，生物膜的表面积、生物量和平均厚度均有所降低。若操作得当，掌握该技术后，不包括孵育时间，整个实验可在三到四小时内完成。

在进行该操作时，需注意尽量减少清洗步骤中对生物膜的移除和破坏。完成该操作后，可进一步开展细胞计数、酶稳定性测定等其他方法，从而回答更多问题，例如群体感应淬灭乳糖酶对生物膜内细胞群体的影响及其作用持续时间。

该技术问世后，为传染病治疗领域的研究人员探索潜在的群体感应淬灭型内酯酶对致病菌生物膜作用提供了新的途径。观看本视频后，您应能够熟练掌握通过结晶紫染色定量分析生物膜破坏程度的方法，并通过共聚焦成像评估生物膜的形态学变化。请务必注意，操作致病性材料可能具有极高的危险性。

进行此操作时，应始终采取适当的预防措施，例如使用合格的生物风险 containment 设施。