自动化模块化高通量胞外多糖筛选平台结合高灵敏度碳水化合物指纹图谱分析

本方法的总体目标是快速、可靠地筛选微生物胞外多糖产生菌，并鉴定其碳水化合物指纹图谱。这是充分利用尚未开发的胞外多糖多样性所必需的关键步骤。我们的方法有助于加快微生物胞外多糖领域的聚合物研究进程。

该技术能够快速鉴定出具有不同特性的新型多糖变体，以满足特定应用需求。此方法的主要优势在于将多种胞外多糖检测系统结合到一个模块化且完全自动化的筛选体系中，从而实现了极高的速度和可靠性。

该技术也可在无自动化平台的实验室中手动操作，因此其使用非常灵活，可针对不同的筛选需求进行调整。这种胞外多糖（EPS）筛选平台采用模块化设计，可将实验流程分为两个主要部分：自动化筛选和碳水化合物指纹图谱分析。第一步是培养待筛选的菌株，并通过离心去除菌体细胞。

将菌株在96孔板中以葡萄糖作为碳源进行培养，孔板覆盖透气密封膜，并在30摄氏度、1,000 RPM条件下置于微孔板摇床上振荡培养。在筛选当天，按照方案文本所述准备机器人工作台和储存转盘。从孔板上移除透气密封膜，并将主培养物分配至转盘位置1-1至1-4。

启动自动机器人程序。培养结束后去除细胞时，将主培养深孔板从转盘转移到离心机中，在 4,300 × g 和 20 摄氏度条件下离心 30 分钟。过滤前沉淀步骤中，将微孔板以及含 pH 指示剂的微孔板从转盘转移至工作台。

同时将过滤板和收集板转移至工作台指定位置，其中过滤板可确保完全去除所有细菌细胞。离心后，取180微升主培养上清液加入过滤板中。从主培养上清液中吸取150微升，其中50微升加入微量滴定板中用于过滤前的沉淀处理，另100微升加入pH指示剂板中。

通过2-丙醇沉淀上清液以评估EPS的产生。使用12.5毫升多通道移液器手动向每个孔中加入150微升2-丙醇。将微量滴定板在室温下以900 RPM振荡10分钟后，目视观察表明EPS产生的纤维或片状结构。

将主培养板放回转盘后，检查发酵液，经离心后其沉淀量应减少。黏度增加是产生胞外多糖（EPS）的另一迹象。第二项任务是通过96孔过滤法确保从黏稠的发酵液中完全去除细胞。

在 3,000 × g 和 20 摄氏度条件下，将过滤板离心 10 分钟。然后将板放回其转盘上的初始位置，并按照方案文本所述进行凝胶过滤的平衡。接下来，将 35 微升滤液移液至已平衡的凝胶过滤板中央，将 50 微升滤液移液至用于沉淀的微量滴定板中。

将凝胶过滤板转移至离心机，并将工作台上的所有其他板移回旋转架中的原始位置。待所有板均存放回旋转架后，注意观察滤板中残留物所提示的高黏度上清液。滤液缺失可能导致后续分析模块出现假阴性结果。

自动化筛选中的第三项任务是通过96孔凝胶过滤法从培养基中去除残留的单糖。将凝胶过滤板在1,000 × g离心力、20摄氏度条件下离心两分钟。通过机器人操作装置准备工作站，以处理凝胶滤过液。

为了检测凝胶过滤后残留的葡萄糖，使用 50 微升吸头将 25 微升双蒸水转移至新的微孔板中。吸取 20 微升双蒸水、5 微升空气和 5 微升凝胶滤过液，并将其加入同一微孔板中。使用 200 微升吸头从工作台位置 1-2 吸取 50 微升葡萄糖检测试剂混合液，以开始第一项检测。

将微量滴定板放入孵育箱中。孵育30分钟后，将板从孵育箱转移至微量滴定读板仪，记录在418和480纳米处的吸光度。为采用苯酚-硫酸法测定总碳水化合物含量，用移液器将20 µL凝胶滤液加入微量滴定板中。

手动将板从转盘中取出，并放入液体处理工作站中。包括含有不同葡萄糖浓度的校准板，每种浓度设三个复孔，每孔20微升。在位置1放置一个废液容器，在位置2放置一个300微升吸头盒，在位置3放置一个250毫升试剂槽，内含110毫升新配制的苯酚-硫酸溶液。

使用带有300微升吸头的8通道移液器，将180微升苯酚-硫酸溶液加入每块板的每一行中。用盖子盖好所有微孔板，并在室温下以900 RPM振荡5分钟进行混匀。在80摄氏度的烘箱中孵育35分钟，以进行显色反应。

在通风橱中冷却平板后，在 480 纳米处测定吸光度。若自动筛选获得的菌株满足以下三项标准中的至少两项，则被判定为 EPS 阳性：黏度对照、聚合物检测以及计算的葡萄糖当量。

葡萄糖当量通过此方程计算。筛选平台的碳水化合物指纹图谱包含最后三个手动操作的任务。任务二中阳性结果的剩余滤液为任务五中的凝胶滤液提供了基础。

任务六是对凝胶滤过液进行96孔微量水解。为此，首先使用12通道50微升移液器将20微升凝胶滤过液转移至新的PCR板中。然后使用多通道移液器向每个孔中加入20微升4摩尔的三氟乙酸。

用热塑性弹性体封板膜覆盖PCR板，并将PCR板放入专用夹紧装置中。通过翻转夹紧装置10次来混匀溶液。离心PCR板后，将其固定在夹紧装置中，再将固定好的夹紧装置置于预热的沙浴中，在121摄氏度下孵育90分钟。

使用12通道200微升移液器，加入3.2%氨溶液以将pH值调节至约8。用热塑性弹性体封板膜覆盖PCR板，并使用夹紧装置手动振荡。最后一步是通过高通量-1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（HTPMP）方法分析碳水化合物指纹。

开始此操作时，使用12通道50微升移液器将25微升中和后的水解产物转移至新的PCR板中。加入75微升衍生化试剂混合液，并用热塑性弹性体密封垫密封PCR板。将PCR板置于PCR仪中，在70摄氏度下反应100分钟，随后冷却至20摄氏度。

取20微升等分试样转移至新的微量滴定板中，然后使用12通道200微升移液器向每孔加入130微升19.23毫摩尔/升的乙酸。通过反复吸液和排液至少六次进行直接混匀，并将全部液体转移至带有微量滴定收集板的0.2微米滤膜板。以1,000 × g离心5分钟，取下滤膜板，用硅胶盖板密封微量滴定收集板。

将微量滴定板放入超高效液相色谱-紫外-电喷雾电离-质谱仪（UHPLC-UV-ESI-MS）中，用于测定碳水化合物指纹图谱。本表格展示了利用该筛选平台成功鉴定的三个代表性新菌株的结果。表格左侧显示了自动化筛选模块在粘度形成、聚合物产生以及总水解葡萄糖当量方面的结果，这些参数被用作碳水化合物指纹图谱详细分析的评估指标。

基于校准的糖类以及未知糖类、二聚体和取代基的碳水化合物指纹图谱显示在表格的右侧部分。利用该信息，可计算单体组成，并与已知的聚合物结构进行比较。此外，还可针对具有研究价值的单体组成和稀有碳水化合物进行靶向筛选。

一旦掌握，该技术可在短短五小时内完成386个菌株的检测。在本实验流程基础上，还可加入已有的丙酮酸检测或其他乙酸盐、磷酸盐检测，以进一步探究胞外多糖表达的相关问题。该技术因其高灵敏度，在建立后为我们在基因工程改造的微生物胞外多糖生产领域的研究铺平了道路，使我们能够探索胞外多糖生物合成途径的改变对其化学结构的影响。

观看本视频后，您应能够很好地掌握如何快速且可靠地鉴定新型胞外多糖产生菌的方法。