高通量木质纤维素材料糖化分析方法

你好，我是 Kara Ted，我是 Leo。支持我。我是 Simon McQueen Mason。

植物生物质的可消化性是当前备受关注的研究课题。这是因为在构成生物质的植物细胞壁多糖中蕴藏着大量糖类物质，如果我们能够将这些糖类以可利用的形式释放出来，就可以通过发酵生产各种产品，例如燃料和化学品。然而，这些材料极难消化，因此深入理解调控其可消化性的因素已成为一项紧迫的任务。

为了能够利用植物材料生产可再生资源，我们需要能够测定这些植物的糖化潜力。因此，在约克大学，我们正在对大量植物材料进行筛选，以确定它们的糖化潜力。糖化是指将复杂碳水化合物分解为其单糖组分的过程，进而通过不同的工业工艺生产有价值的化学品。

为了测定纤维化潜力，我们在微尺度水平上模拟工业过程，对生物质进行预处理和酶水解，以测定所释放的糖量，从而鉴定出具有优良性状的基因型品种。该高通量系统采用IG六孔板格式运行。

采用温和的水解条件以揭示不同基因型之间的细微差异，该方法还具有足够的灵活性，可支持不同的底物材料，并可用于评估不同的酶。我们使用的方法包括将植物材料制成粉末，然后在90摄氏度下用稀释的酸或碱预处理20分钟。接着，在50摄氏度下使用商品化的纤维素酶混合物进行酶解消化，持续八小时。

最后，采用 MBTH 法测定还原糖的释放量。植物材料以干燥茎秆形式收获，并切割成 4 毫米长的片段。将这些片段与 3 个直径 5 毫米的金属球一同放入 2 毫升小瓶中。

每个小瓶均带有独立的条形码标签，通过扫描条形码确保样本的可追溯性。将样本装入机器人中的研磨与分装设备。样本会自动被研磨并混合，以便将生物材料分装至96孔板中。

将小瓶穿刺后，再重新定位到机械臂中，使其位于一个振动漏斗内，通过振动将粉末分配出去。漏斗的振动由天平调控，以确保每孔分配的粉末质量达到目标量。将生物量分配至板的10列中，预留两列为标准品孔。

通过每个样品进行四次重复，我们每块板加载20个样品。该板的水解产物将被分装到三块PCR板中，从而得到三块光学检测板。通过这种方法，我们可对每块生物质样品孔中的还原糖进行三次测定。

处理完成后，使用硅胶垫密封板以防止蒸发。待其准备就绪后，转移至液体处理机器人。在液体处理过程中，机器人可自动完成预处理、酶解及释放糖类的测定。

两张两米长的实验台分别放置了不同试剂所需的容器，以及塑料器皿的储存空间。台面上设有用于预处理和水解的培养箱，以及用于糖含量测定的PCR仪。预处理在深孔板中进行。

通过向生物质粉末中加入稀酸或稀碱溶液。将平板转移至加热块中，在90摄氏度下孵育20分钟。孵育结束后，用500微升醋酸缓冲液洗涤五次，以去除预处理试剂。

预处理步骤冲洗完毕后，加入酶混合液。该混合液为标准配比，包含纤维素酶和Novozyme 188，二者比例为4:1，浓度为每孔7 FPU。

将培养板在50摄氏度下振荡孵育8小时。取75 µL所得水解产物转移至PCR板中。在PCR板的第11和第12列中加入葡萄糖标准品。

随后向所有孔中加入25微升1摩尔的氢氧化钠。最后，将50微升MBTH试剂移液至PCR板中。在将水解物转移至第三块PCR板后，深孔板被储存保存。

将PCR板转移至热循环仪中，在60摄氏度下孵育15分钟。该过程的最后一步是将反应混合液转移至光学板中以进行显色反应。孵育结束后，从热循环仪中取出PCR板。

向转移后的反应混合物中加入 100 µL 氧化试剂。为促进显色反应，液体处理程序在 24 小时内运行四次，其中预处理冲洗和酶的添加过程约需两小时。酶水解过程耗时八小时，糖的测定再需两小时。

当第一块平板孵育八小时的同时，下一块平板开始进行处理。通过这种机器人资源分配方式，每天可完成三轮实验，每轮处理80个样本，以测定释放的还原糖量。光学平板的测定波长为620纳米。

所获得的结果经过分析，以量化反应每小时每毫克释放的糖量，单位为纳摩尔每毫克每小时。感谢观看，希望本视频能为您的生物燃料研究带来启发。