一种从小鼠脾脏中分离与扩增不变的自然杀伤T细胞的优化方法

本实验的总体目标是从鼠脾脏中分离并扩增不变的自然杀伤T细胞（invariant natural killer T, iNKT细胞）。首先分离脾脏单个核细胞，然后通过磁性细胞分选法富集CD5阳性淋巴细胞群体，再通过荧光激活细胞分选法进一步分离脾脏中的iNKT细胞组分。

在最后一步中，分选得到的 iNKT 细胞将在体外进行扩增培养。最终，可通过 ELISA 检测扩增后 iNKT 细胞的细胞因子谱。通常，初次操作此方法的研究者会遇到困难，因为 iNKT 细胞的纯化与扩增需要综合运用多种技术并加以熟练操作。

该操作将由我实验室的一名研究生完成。脾脏收获后，将组织转移至70微米尼龙滤器中，然后使用2毫升注射器活塞轻轻将脾脏压过滤器，进入50毫升锥形管，并用5毫升PBS冲洗滤器。随后，向15毫升离心管中加入3毫升淋巴细胞分离液，再将5毫升细胞悬液沿管壁缓慢叠加于密度梯度液上方。

通过离心分离细胞，并将界面层转移至新的15毫升离心管中。随后用10毫升预冷的PBS洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于2毫升fax缓冲液中，以富集CD5阳性脾淋巴细胞。用fax缓冲液将细胞浓度调整至每90微升含1×10⁷个细胞，然后向细胞中加入10微升抗CD5磁珠。

在 4 摄氏度下孵育 15 分钟后，用 4 毫升 fax 缓冲液洗涤细胞，并将沉淀重悬于 500 微升新鲜 fax 缓冲液中。根据制造商的建议，通过磁性细胞分选法分离 CD5 阳性细胞。然后，在含有抗 CD16、CD32 和 PE 标记的 α-GalSph CD1d 四聚体的 fax 缓冲液中，将富集的 CD5 阳性淋巴细胞稀释至每 20 微升含 1 × 10⁶ 个细胞，在室温避光条件下反应 30 分钟。随后，将细胞与目标抗体在 4 摄氏度避光条件下继续孵育 30 分钟。

然后用新鲜的fax缓冲液洗涤细胞，并加入10 µL浓度为20 µmol/L的工作液DPI，作用于1×10⁶个细胞，孵育5分钟。在室温下，通过流式细胞仪获取约1×10⁴个富集的CD5阳性淋巴细胞事件，电子门控设定为前向散射（FSC）低信号的细胞群，以排除细胞双联体和聚集体。在前向散射低信号的细胞群中，进一步设门排除DAPI阳性、CD8阳性及CD19阳性的细胞，并使用侧向散射（SSC）与前向散射（FSC）的面积图进行分析。

通过CD3ε对α-半乳糖基鞘氨醇（alpha gal SER）CD1d四聚体进行电子圈选，并如图所示，电子圈选α-半乳糖基鞘氨醇CD1d四聚体阳性且CD3ε阳性的iNKT细胞。随后，在获取不超过2×10⁵个CD5阳性富集淋巴细胞的基础上，确定富集细胞组分中α-半乳糖基鞘氨醇CD1d四聚体阳性且CD3ε阳性的iNKT细胞所占百分比。使用低纯度分选门控，将α-半乳糖基鞘氨醇CD1d四聚体阳性且CD3ε阳性的iNKT细胞分选至含有1 mL胎牛血清的离心管中，完成分选。

用 10 毫升 RPMI 1640 培养基冲洗离心管壁上的分离 NKT 细胞。然后离心收集细胞，将细胞沉淀重悬于 1 毫升 RPMI 1640 培养基中，并取 40 微升细胞悬液用于评估分选细胞的纯度，采用相同的设门策略。

关于设定分选参数以扩增 INKT 细胞，首先离心收集细胞，然后将分离的细胞重悬于完全 RPMI 1640 培养基中，终浓度为每毫升含 5 × 10⁵ 个细胞，并添加 IL-2、IL-12 和抗 CD28 抗体。随后将细胞以每孔 1 × 10⁵ 个 INKT 细胞的密度接种至 96 孔平底、抗 CD3ε 包被的培养板中，在细胞培养箱中 37°C 条件下孵育。两天后，将细胞转移至新的未包被的 96 孔平底培养板中，在完全 RPMI 1640 培养基中于静息条件下继续培养。

继续培养两天。分选后的第四天，轻轻吹打每孔的上清液以悬浮细胞，并将细胞收集至15毫升锥形管中。离心后，重悬细胞沉淀，浓度为每毫升5×10⁵个细胞。

在添加了IL-7的完全RPMI 1640培养基中，以每孔1×10⁵个细胞的密度接种于新的平底96孔板中。四天后，将细胞重新取出，转移至一个新的15毫升圆锥形离心管中进行离心。将细胞沉淀重悬于含有可溶性抗CD28抗体的完全RPMI 1640培养基中，并接种至预先包被有抗CD3ε抗体的平底96孔板中，每孔接种1×10⁵个细胞，然后将细胞放回培养箱继续培养3至4天，即第11至18天。

在第19天重复进行如上所述的IL-7、抗CD28和抗CD3ε处理。将细胞转移至新的15毫升锥形管中。离心沉淀细胞，并将细胞沉淀重悬于完全RPMI 1640培养基中，浓度为每毫升5 × 10⁵个细胞。

然后将细胞以每孔1 × 10⁵个细胞的密度接种于平底96孔板中，并将细胞置于细胞培养孵育箱中静置培养两天。在存在IL-2、IL-12和可溶性抗CD28抗体的条件下，用包被有抗CD3ε抗体的培养板刺激分选后的iNKT细胞，可在培养两天后使iNKT细胞数量扩增约三倍。随后在IL-7存在下进一步扩增iNKT细胞，可在培养第四天时使iNKT细胞数量增加三至四倍。

值得注意的是，在不同时间点更换培养基时无明显细胞损失的情况下，重复这些培养条件经过两轮扩增后可获得平均 7 × 10⁷ 个 INKT 细胞，即在 18 天内实现至少 70 倍的扩增。进一步扩增的 INKT 细胞经由包被在培养板上的重组小鼠 CD1D（负载 α-半乳糖醛酸）激活后，在刺激后 48 小时可产生 IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α 和 IL-6，表明这些 INKT 细胞在扩增后仍保留产生 Th1 和 Th2 型细胞因子的能力。

在进行该实验操作时，必须牢记：使用负载α-半乳糖神经酰胺的CD1d四聚体对iNKT细胞进行正确染色，对于通过流式细胞术鉴定iNKT细胞至关重要。当然。