用于神经递质光学检测的细胞型神经递质荧光工程报告系统（CNiFERs）的构建 体内

本视频的总体目标是介绍基于细胞的神经递质荧光报告系统（CNiFERs）的构建与检测方法，该系统可用于在活体中光学监测特定神经递质的释放。该方法有助于解答神经科学领域中关于脑内神经调质释放时序的关键问题。该技术的主要优势在于，它可适用于任何通过G蛋白偶联受体（GPCS）信号通路发挥作用的神经递质或神经调质。

该方法的区域性示范具有重要意义。体内注射以及随后对CNiFERs的成像在技术上具有挑战性。开始此操作时，请参见T-25培养瓶中的HEK293细胞，这些细胞含有基于前端的钙离子检测器和嵌合G蛋白。

然后，将细胞置于37摄氏度、5% CO2的加湿培养箱中培养，直至细胞融合度达到约50%。随后，吸去T-25培养瓶中的培养基。加入2毫升慢病毒培养基混合液，将T-25培养瓶置于37摄氏度、5% CO2条件下继续培养。

第二天，加入一毫升胰蛋白酶消化，收集感染的 HEK293 细胞。随后将细胞沉淀重悬于五毫升 HEK293 生长培养基中。取一毫升细胞接种于 T-75 培养瓶中用于冻存，另取 1.5 毫升细胞接种于 T-25 培养瓶中用于 FACS 分析。

对于10点激动剂曲线实验，为检测感染的细胞，将纤维连接蛋白包被的96孔板的前两行每孔加入100微升细胞悬液进行接种。随后，将培养于T-25培养瓶、T-75培养瓶和96孔板中的HEK293细胞在37°C、5%CO₂条件下孵育一至两天，直至细胞融合度达到约90%。在进行FACS分析前，通过制备包含10种不同激动剂浓度（涵盖预测EC50值范围）的药物板，以确定GPCR的功能性表达。

使用倍比稀释法配制不同浓度的激动剂，并创建模板以记录药物浓度。接下来，将酶标仪温度设置为37摄氏度。然后，对96孔荧光共振能量转移（FRET）酶标仪进行编程，用于检测FRET信号并执行溶液转移操作。

使用基因编码的基于 FRET 的钙离子传感器 TNXXL 测量 FRET 时，将激发波长设定为 436 ± 4.5 纳米。然后，为 ECFP 和黄色荧光蛋白（citrine）设置相应的发射滤光片和截止滤光片。接下来，编程微孔板读数仪，每 4 秒测量一次荧光发射，持续 180 秒。

从三倍化合物板中选择100微升板体积、150微升移液高度以及递送50微升药物的选项。将药物递送的时间点设置为30秒。随后，吸出A行和B行中的培养基，并向约90%融合的96孔sniffer板中加入100微升ACSF。

然后，将三倍药物板和96孔进样板放入酶标仪中。在启动程序前，让酶标板在37摄氏度下平衡30分钟。酶标仪运行结束后，将荧光读数导出为文本文件。

然后，将此文件导入先前制作的电子表格模板中，该模板可将荧光强度归一化至刺激前基线，计算每种激动剂浓度下的峰值FRET比值，并生成剂量反应曲线。通过将玻璃毛细管置于垂直电极拉制仪上，制备CNiFER注射移液管。使用一对镊子将电极尖端折断至直径约为40微米。

将一块浸有ACSF的海绵置于已麻醉小鼠颅骨上预先制备的2×3毫米薄颅窗处，以保持湿润，同时准备用于注射的细胞。接着，收获在T-75培养瓶中生长至约80%融合度的CNiFER克隆。吸除培养基，并用无菌PBS洗涤细胞。

移除 PBS，加入 10 毫升 ACFS 以使细胞从培养瓶底部脱落。然后吹打细胞以分散细胞团块。在细胞培养离心机中离心 2 分钟。

移去上清液，并将沉淀物重悬于 100 微升 ACSF 中。随后，在 1400 × g 条件下离心 30 秒，移去上清液，保留覆盖有 ACSF 的沉淀物。之后，用矿物油回填注射移液管。

将移液管安装到纳米注射仪上。在小鼠准备区域附近的塑料石蜡膜条上放置五微升 CNiFER 细胞悬液。用拉制的移液管吸取 CNiFER 细胞。

现在，将移液管移动至目标的 x 和 y 坐标位置。降低移液管，刺穿此前已处理变薄的颅骨。继续下移至颅骨表面以下约 200 至 400 微米处，即大脑皮层的第二层和第三层。

使用纳米注射器在最深的位置注入 4.6 纳升的 CNiFER 细胞。注意观察油液与细胞界面的移动情况，然后等待五分钟，使细胞充分释放。

将移液管回撤约100微米，并再次注入4.6纳升的CNiFER细胞，然后等待五分钟。之后，缓慢而轻柔地撤出移液管，以防止CNiFER细胞回流。在此步骤中，将固定头部的小鼠置于成像平台上，并将其放置在双光子成像显微镜下，使用10倍水浸物镜进行观察。

插入用于FRET成像的滤光立方体，该立方体配备505纳米的二向色镜，以及用于检测ECFP的460纳米至500纳米带通滤光片和用于检测citrine的520纳米至560纳米带通滤光片。然后，向含有减薄颅窗的孔中加入ACSF，并将10倍水浸物镜浸入ACSF中。结合汞灯和GFP滤光立方体使用目镜，以定位CNiFER细胞。

现在，切换至40倍水浸物镜。接着，选择适合双光子成像的光路。打开近红外飞秒脉冲激光器。

选择820纳米的波长，功率设置为5%至15%。将PMT一和PMT二的电压设置为亚最大值，通常为500–1000伏，具体取决于PMT的型号。然后，将每个通道的增益设置为1，并将物镜的Z轴位置归零。将物镜从皮层表面降低约100至200微米，然后开始XY扫描。

调节每个通道的激光功率、增益和光电倍增管（PMT）电压，以优化 CNiFER 荧光的信噪比。接下来，使用软件将成像范围限定为包含 CNiFER 细胞的区域以及一个背景区域。选择 Cowman 线，进行双线平均，以获得合适的信噪比，并以每像素 4 微秒的速度设置 3 至 1 赫兹的扫描速率。

之后，在CNiFER细胞周围绘制一个感兴趣区域（ROI），每层包含大约三到四个细胞。设置对ROI的平均荧光强度进行实时分析。

然后，开始采集以随时间监测CNiFER荧光，并启动电刺激或行为学实验，同时监测FRET。在此示例中，使用带有溶液递送系统的酶标仪测量了D2R CNiFER的FRET响应。该图显示了多巴胺作用于D2 CNiFER期间的FRET响应。

请注意，随着多巴胺浓度增加，ECFP的发射光减弱，而锦葵素（citrine）的发射光增强。此处显示的是相应的FRET比率图。图中展示了D2 CNiFERs对多巴胺和去甲肾上腺素的剂量反应曲线。

此外，还展示了缺乏 D2R 的响应型对照 CNiFER。该柱状图显示了其他神经递质和调节物在 50 纳摩尔和 1 微摩尔浓度下的 FRET 比值响应。此处，对黑质中的多巴胺能神经元进行电刺激，可引起 D2 CNiFER 的 FRET 比值发生显著变化。

注意观察反应幅度如何随着电刺激强度的增加而增强。将刺激与可卡因注射相结合可增强CNiFER的反应。观看本视频后，您应充分了解如何构建、测试和使用CNiFER进行活体成像。

在CNiFERs细胞的整个研发过程中，必须始终保持无菌操作技术，因为这些细胞最终将被植入活体小鼠体内。CNiFERs技术的实现为神经科学领域的研究人员提供了一种重要工具，可用于光学检测通过G蛋白偶联受体传递信号的任何神经递质或神经调质的释放情况。感谢观看，祝您的实验顺利成功。