肌萎缩侧索硬化症模型中突触功能的实时荧光检测
2021年7月16日
描述了两种相关方法，用于可视化突触传递所需的亚细胞事件。这些方案通过活细胞成像技术，实现对突触前钙离子内流和突触囊泡膜融合动态过程的实时监测。 体外 培养的神经元
这些方法能够快速评估实验干预、致病蛋白或RNA是否会影响突触过程，以及治疗性化合物是否能够恢复其功能。与电生理学方法相比，这些技术可在相对较短的时间内对一组神经元的突触功能提供可靠的读出结果。本方案可应用于任何神经元发育或退行性疾病的研究。
该方法适用于原代啮齿类神经元培养物以及由诱导多能干细胞衍生的神经元。首先，使用共聚焦成像采集软件优化图像采集参数。在所有样品中保持激发光功率、曝光时间、探测器增益和帧率恒定。
进行延时成像时，选择 512 × 512 的宽高比和每秒两帧的帧率，以最小化染料漂白。然后为 GCaMP6m/GCaMP3 配合 Fitzy 以及硬脂酰染料配合 Trixi，选择相应的荧光激发、二向色镜和发射滤光片组合。为避免延时成像过程中出现 Z 轴漂移，请使用共聚焦成像采集软件中的完美对焦（perfect focus）功能。
接下来，在图像采集面板中选择时间选项卡。第一阶段设置间隔为500毫秒，持续时间为三到五分钟；第二阶段设置间隔为500毫秒，持续时间为五分钟。
然后组装用于人工脑脊液（ACSF）的重力灌注装置，将高氯化钾ACSF缓冲液加入装置顶部的50毫升注射器中，并将流速设置为每分钟1毫升。接着，将盛有神经元的35毫升玻璃培养皿置于共聚焦成像载物台上，使灌注管末端位于培养皿边缘，并选择成像视野。转染后48小时，在37摄氏度条件下，用低氯化钾ACSF缓冲液孵育原代皮层神经元或运动神经元10分钟。
然后用移液器吸除缓冲液，在避光条件下将神经元接种至底部为玻璃的培养皿中，培养皿内预先加入含有50毫摩尔氯化钾和10微摩尔styryl染料的ACSF溶液。五分钟后，移除染料加载液，将神经元置于含低浓度氯化钾的ACSF缓冲液中，在37°C下孵育10分钟，以去除非特异性染料标记。随后将培养皿置于倒置共聚焦显微镜的成像载物台上，使用20倍空气物镜或40倍油浸物镜观察细胞。
使用546纳米激光激发钢染料，并通过570至620纳米带通滤光片收集发射光。选择成像视野并启用完美聚焦后，采集一幅包含明场、Trixi和荧光标记通道的静态图像，以标记神经元边界。随后在采集软件中启动“立即运行”，进行三到五分钟的基础记录，以排除染料强度的变异影响。
在切换至第二阶段的瞬间，启动灌流系统的开关，持续向神经元灌注50毫摩尔的氯化钾溶液，以促进染料的释放。记录过程持续五分钟，随后关闭灌流系统开关。使用共聚焦软件将实验数据保存，以供后续分析。
转染GCaMP six M后48小时，用低氯化钾ACSF孵育原代啮齿类动物皮层神经元15分钟。随后将培养皿置于成像平台上，使用Fitzy滤光片和20倍或40倍物镜观察GCaMP six M荧光信号。选择成像视野并启用完美聚焦功能后，采集一幅包含明场、Fitzy和荧光标记通道的单张静态图像，以标记神经元边界。
接下来，在采集软件中启动“立即运行”，进行三到五分钟的基础记录。然后灌注含有50毫摩尔氯化钾的ACSF溶液至神经元，如前所述，并记录五分钟。当图像采集结束后，保存实验数据，并使用共聚焦软件进行数据分析。
进行图像分析时，在共聚焦软件中打开延时图像，并通过依次点击“图像”、“处理”、“对齐当前文档”，然后选择“与第一帧对齐”来对图像进行对齐。使用ROI选择工具沿神经突选择感兴趣区域，并标记一个代表背景荧光强度的ROI。接下来，从时间测量面板启动“测量”功能，以测量所选ROI随时间变化的原始荧光强度。
测量完成后，将原始荧光强度导出至电子表格软件。图中显示的是加载了苯乙烯染料的大鼠原代皮层神经元。通过与突触小泡标志物突触素（synaptophysin）共标记来确定染料加载的特异性，大多数染料阳性斑点与此标志物共定位。
对整个成像期间的原始荧光强度值进行分析显示，突触素的强度保持恒定，而染料荧光强度在刺激后下降。对于转染绿色荧光蛋白的对照神经元，成功的突触囊泡释放导致在高浓度氯化钾去极化后染料荧光显著减弱。该代表性视频显示了一个神经元在刺激后于右侧新区域选择性释放染料荧光。
相比之下，在转染了与染料肽重复序列构建体相连的C9ORF72-GA50的神经元中，即使在高浓度氯化钾去极化后，染料荧光仍保留在细胞内，表明突触传递功能受损。此处展示了转染GCaMP6m的皮层神经元在氯化钾去极化前后具有代表性的荧光图像。转染GCaMP6m的皮层神经元荧光信号增强，表明在氯化钾诱导的去极化后钙离子进入神经突。
在基线记录期结束时，神经元表达的GCaMP六M荧光较弱。刺激开始后，可观察到荧光显著增强。请确保styryl染料和GCaMP的荧光基线记录稳定。
始终使用完美对焦以避免图像漂移，否则将导致后期图像数据处理困难。不建议在灌流过程中继续培养神经元，因为培养皿会暴露于空气中。然而，可通过免疫染色或蛋白质、RNA 提取来评估突触改变的潜在原因。
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概述
本研究讨论了两种用于观察与突触传递相关的亚细胞事件的方法，重点在于对培养神经元中突触前钙离子内流和突触囊泡膜融合进行实时监测。所介绍的实验方案可用于评估与突触过程相关的实验干预，并研究潜在的治疗策略。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 突触传递
- 活细胞成像
背景
- 理解突触过程对于阐明神经元发育和退行的机制至关重要。
- 实时成像能够监测钙动力学和突触小泡的释放。
- 这些技术可适用于多种神经元模型，包括啮齿类动物原代培养神经元和诱导多能干细胞衍生神经元。
研究目的
- 建立可靠的方法以监测突触功能，并评估实验性或治疗性化合物的影响。
- 研究与疾病相关的蛋白质或RNA对突触传递的作用。
- 提供一种替代传统电生理评估的快速方法。
使用的方法
- 采用共聚焦显微镜对体外培养的神经元进行活细胞成像。
- 使用的生物模型包括原代啮齿类动物皮层神经元以及由诱导多能干细胞分化的神经元。
- 成像时间线包括以3-5分钟为间隔的相位成像，用于数据采集。
- 详细描述了染料负载和成像参数的具体方案，以提高成像质量和数据可靠性。
主要结果
- 突触小泡释放的成功可视化表明，钙离子动态与突触功能相关。
- 在某些实验条件下，荧光染料的滞留提示突触传递功能受损。
- 荧光强度测量为去极化前后突触活动提供了洞察。
- 研究结果支持该方法在理解和治疗突触功能障碍方面具有潜在的治疗应用价值。
结论
- 该研究能够可视化突触传递中的关键事件，有助于评估神经元的健康状况。
- 所开发的方法可促进针对突触过程的治疗性化合物的探索。
- 总体而言，这些方法从根本上推动了我们对突触机制及潜在疾病干预策略的理解。
常见问题
行业执行相关性
突触功能的实时荧光检测可对神经元模型中的突触前活动提供快速、定量的读数，从而实现对化合物在神经传递中作用的早期评估。该方法通过将分子水平的扰动与突触功能输出相关联，支持神经退行性疾病项目中的靶点验证和作用机制去风险化。其可多重检测的设计允许与疾病相关蛋白的过表达相结合，便于在肌萎缩侧索硬化症（ALS）及相关模型中进行表型筛选和转化生物标志物的匹配。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过测量去极化介导的突触囊泡胞吐和钙离子内流，作为神经元功能健康状态的功能性读数，从而验证治疗假设。
- 操作价值：能够快速筛选可能在疾病模型中恢复突触功能的化合物，减少对较慢速的电生理学方法的依赖。
- 预测价值：利用原代啮齿类动物皮层神经元和运动神经元，在FUS-ALS和C9ORF72-ALS模型中定量评估突触功能的挽救效果，支持项目组合的优先级筛选。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：生成styryl染料丢失和GCaMP6m增加的归一化荧光读数，提供囊泡释放和钙动力学的明确且可量化的指标。
- 可重复性：要求在不同样本间保持一致的激发光功率、曝光时间、探测器增益和帧率，以确保可靠的纵向比较。
- 可扩展性：兼容高内涵成像平台和灌流系统，支持在3–5分钟的基础期和5分钟的刺激期内进行时间序列采集。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：直接模拟 FUS-ALS 和 C9ORF72-ALS 中的突触功能障碍，捕捉神经退行性变发生前的早期病理生理变化。
- 转化连续性：通过提供与运动和认知领域神经元通讯缺陷相关的功能性读数，连接发现阶段与临床前验证。
- 基于风险的决策：能够评估与疾病相关的蛋白质或RNA是否损害突触传递，从而为靶点可信度评估和先导分子筛选提供依据。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点验证到先导化合物发现，再到临床前药效测试的整个发现流程，尤其适用于突触功能障碍作为早期生物标志物的神经退行性疾病研究项目。
- 发现生物学：通过将基因或药物干预与突触囊泡循环及突触前钙流的变化相关联，支持假设验证。
- 筛选：提供即用型定量检测结果（随时间变化的荧光强度），可在不同条件下比较化合物的作用效果。
- 分析：提供标准化的荧光测量数据，使研究团队能够相对于基线评估突触功能的恢复或损伤情况。
- 转化研究：利用原代神经元和诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元，模拟与人类相关的肌萎缩侧索硬化症（ALS）基因型中的突触功能缺陷，从而与生物标志物研究策略相契合。
- 企业级复用：建立可重复使用的成像平台，用于在多个项目和治疗模式中对突触健康状况进行纵向评估。
运营与企业影响
- 科学价值：通过减少基因损伤与功能性突触结果之间的机制模糊性，提高预测可信度。
- 操作价值：通过可重复的活体成像方案（包含基线期和刺激期）标准化突触功能评估。
- 战略价值：在神经元模型中提供靶点结合的早期功能性证据，从而优化“进行/终止”决策。
- 项目组合影响：支持对在与肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关的系统中表现出突触功能挽救的化合物进行基于风险调整的优先排序。
实施注意事项
- 需要具备共聚焦显微镜、活细胞成像以及荧光染料操作（styryl染料和GCaMP6m）方面的专业知识。
- 依赖于稳定的灌流系统以及配备完美聚焦功能的图像采集软件，以尽量减少时间序列成像过程中的漂移。
- 需要在不同实验室之间对染色、孵育和灌流方案进行标准化，以确保跨站点的可重复性。
- 应用于iPSC来源的神经元时，需优化转染效率和成熟时间，同时保持KCl刺激参数的一致性。
- 实际限制：灌流后不建议进行长期培养，因暴露于空气会影响样本，从而限制后续检测只能在固定时间点进行，如免疫染色或分子提取。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:52
Microscope and Perfusion System Setup
2:33
Styryl Dye Imaging of Synaptic Vesicle Release
4:30
Fluorescence Imaging of Gcamp6m Calcium Transients
5:36
Image Analysis
6:23
Results: Real-Time Monitoring of the Dynamics of Presynaptic Calcium Influx and Synaptic Vesicle Membrane Fusion in In Vitro Cultured Neurons
8:15
Conclusion
