一种用于可视化胰腺癌细胞线粒体超微结构变化的三维技术

本项目旨在通过改变亚细胞纳米尺度的超微结构，研究药物的抗癌作用，并建立细胞器形态与癌症病理机制之间的关联。该技术结合了传统的电子显微技术与三维重建技术，无需特殊设备。与其他技术相比，该方法可提高成像效率和重建灵活性，能够随时对目标结构进行真实形态的三维重建，因此具有高度的便捷性和普适性。

这种连续超薄切片三维重建技术无需特殊昂贵设备，可反复真实还原立体结构。该技术可随时对所有细胞器进行定性和定量分析，实现了超微结构观察的简便操作。

首先，将200万个Pan02细胞接种于12毫升DMEM培养基中，在37°C、95%湿度、5%二氧化碳和35%空气条件下培养。48小时后，在28 ×g条件下离心培养物2分钟，并弃去上清液。在1.5毫升微量离心管中加入1毫升2.5%戊二醛，于4°C固定细胞，过夜。

第二天，将样品在1006 g下离心5分钟，吸除固定液，然后用0.1摩尔PBS冲洗样品两次。随后用双蒸水冲洗样品两次，每次10分钟。接着加入50微升1%四氧化锇和1.5%亚铁氰化钾按1:1比例配制的溶液，在4摄氏度下孵育1小时。

将样品用0.1摩尔PBS离心并冲洗两次，再用双蒸水冲洗一次。然后加入1毫升1%硫代碳酰肼，室温孵育30至60分钟。孵育后，离心并弃去上清液，再用双蒸水冲洗样品四次。接着，加入50微升1%四氧化锇，室温下固定1小时。

再次离心，并用双蒸水冲洗样品四次。加入1 mL 2%醋酸铀酰溶液，在4°C下染色过夜。用双蒸水冲洗样品后，加入1 mL Walton溶液，在60°C下孵育1小时。

孵育后，用双蒸水冲洗细胞四次，然后依次用梯度乙醇溶液脱水，每次10分钟。接着，在1 mL 100%丙酮中脱水两次，每次10分钟。随后，将200微升丙酮与Pon 812环氧树脂按3:1、1:1和1:3的比例混合，并将样品分别在室温下浸泡于上述树脂中，时间分别为2小时、4小时和4小时。

分别孵育后，将样品在100% Pon 812环氧树脂中浸泡过夜。次日，将样品转移至平底包埋模具中，并于60 °C烘箱内聚合48小时。聚合完成后，使用超薄切片机在水解的硅片上连续切取70纳米厚的切片条带，并于60 °C烘箱中干燥10分钟。

裁剪一段导电碳胶带，将其粘贴在载有胰腺细胞切片的硅片与扫描电镜样品台之间。接着，将场发射扫描电镜（FE-SEM）的加速电压设为2 kV，工作距离设为4 mm。在顶部菜单栏中，点击HL图标。

然后在低倍镜下定位目标切片条的第一部分，再次点击HL图标以切换至高倍镜模式。通过调节图像、亮度、对比度和放大倍数，获取目标结构的合适图像。接下来选择项目视图。

然后打开数据，将待分析的图像文件导入软件中。通过点击“对齐切片”和“编辑”来对齐图像。接着在左下角的菜单栏中，通过调整图像透明度来修改强度范围值。

选择“提取子体积”模块，然后单击“对齐数据集”以匹配整个堆栈重叠部分的大小。接下来，在“分割”子部分中，选择“重采样”。然后进行分割并单击“保存”。

然后选择魔棒工具的阈值和画笔工具的大小，以选中正确的范围。在选择菜单中，单击“添加”图标以添加选定的区域。完成区域分割后，根据物体大小和图像分辨率的最佳效果生成图像文件。

单击裁剪编辑器，在虚拟滑块框中输入数字六。接着，从左侧下拉菜单中，右键单击“项目”子部分下方的灰色区域，选择生成表面，然后选择创建并应用。在生成的文件中，使用表面视图模块创建表面结构和三维表示。

二维场发射扫描电镜图像显示，在对照组中，线粒体均匀分布，且具有规则的嵴结构。相比之下，RSL3组的线粒体出现收缩，膜密度增加，嵴结构模糊。然而，并非RSL3组中所有线粒体嵴均发生退化，部分嵴结构仍保持完整。

与RSL3组相比，抑制剂组的线粒体嵴结构大部分保持完整，仅有少数不明显。对照组的三维图像更准确地展示了线粒体及其嵴的结构。RSL3组的三维图像显示线粒体形态不规则且出现空泡化，而抑制剂组则呈现出多样化的嵴形态。

线粒体形态改变的定量分析显示，与对照组相比，RSL3组线粒体长度和体积显著减小，而抑制剂组呈现中间状态的结果。RSL3还通过改变线粒体形态并触发铁死亡，导致线粒体功能障碍和细胞代谢异常。