通过流式细胞术对小鼠精子细胞进行分步分选

本实验的总体目标是将小鼠精子细胞分离为四个不同的群体，从而实现对精子形成过程的分子研究。该方法有助于解答生殖生物学领域的关键问题，例如染色质重塑对基因组完整性的影响。该技术的主要优势在于能够将精子细胞分离为纯净的细胞群体，且无交叉污染。

我们在观察单倍体参数中染色质重塑过程中DNA染色强度存在显著差异时，首次提出了该方法的设想。在细胞分选前一天，向5毫升聚丙烯圆底管以及15毫升和50毫升聚丙烯锥形管中加入一到两毫升热灭活的FBS。接下来，将管子置于旋转器上，在4摄氏度下缓慢翻转过夜，次日完成包被。

使用 P200 移液器小心地倾去 FBS，以去除 15 和 50 毫升离心管中的任何残留 FBS，并在 5 毫升离心管中保留 100 至 200 微升的少量残留 FBS，用于在细胞分选当天收集纯化的细胞。将包埋的组织样本在 500 微升分选缓冲液中剪碎，然后使用截断的微量移液器吸头将组织碎片转移至 1.5 毫升离心管中。

用移液器轻轻吹打曲细精管以冲洗出生殖细胞，先使用完整尖端的移液枪头进行上下吹打，随后更换枪头继续冲洗。接着，使用40微米细胞滤网去除组织碎片和细胞团块，并将滤过液收集至经胎牛血清（FBS）包被的50毫升锥形管中。用分选缓冲液洗涤滤网一次，使总体积达到3毫升，然后将滤过液转移至经FBS包被的15毫升锥形管中。

然后向细胞悬液中加入每毫升 16 µL 的 EDTA，并使用 10 mL 移液器在低速涡旋条件下，于 1 分钟内缓慢加入三倍体积的冰上预冷的 100% 乙醇以固定细胞，固定后悬液将变为乳白色。将细胞置于冰上孵育 15 分钟，期间偶尔轻柔颠倒混匀。随后离心细胞悬液，将沉淀物重悬于 2 mL 分选缓冲液中，并在分选前立即加入 4 µL cyto 16 DNAD 对生殖细胞进行染色。

将细胞通过50微米滤膜过滤至经FBS包被的离心管中，并用一到两毫升分选缓冲液充分洗涤滤膜。将固定的生殖细胞上样至配备488纳米激光器的流式细胞分选仪。接下来，以直方图显示总事件数，该直方图以Alexa Fluor 488的荧光面积为横轴，表示事件数量，并圈选DNA染色阳性的细胞。

然后将此门中的细胞在侧向散射面积与前向散射面积图上显示并设门。如所示，将这些设门后的细胞在前向散射面积与Alexa Fluor 488面积图上显示并设门。接着，再将这些门内的细胞分别在Alexa Fluor 488宽度与Alexa Fluor 488面积图上显示。

精子形成过程的第1至第9步，以及第10至第12步。随后可通过分选对精子细胞进行门控，以收集第13至第14步和第15至第16步的细胞。精子细胞在前向散射面积与EXOR 4 88面积图中显示来自第一个门控的细胞，并进行门控分析。

如图所示的细胞群。然后将这些门控分别显示在Alexa 488宽度与Alexa 488面积图上，并进行门控。

步骤13至14以及15至16用于精子分选。最后将纯化的组分收集到预冷的、经FBS包被的5毫升圆底试管中，每管含100至200微升FBS，并置于冰上。在这些图像中，显示了经流式分选后精子群体的DAPI染色结果。

精子形成第1至第9步的精子细胞通常表现出呈圆形的细胞核，在精子形成过程中则呈现椭圆形。第9步的精子细胞在第10至第12步中被观察为拉长的钩状结构。第13至第14步以及第15至第16步的精子细胞其细胞核形状相似，但DNA染色强度略有不同，这一差异使得在流式细胞术分选过程中能够区分这些不同的精子细胞群体。

按照所示方案操作，所获得的单个S型实验种群纯度预计可达95%至100%。该技术可在6至8小时内完成。只要严格遵循每一步操作，并始终注意在实验过程中将细胞置于冰上，即可获得不同精子种群，从而提供足量的材料用于分子分析，例如表征剧烈的染色质重塑过程，或研究此转变过程的遗传学影响。