一种用于水样中小分子污染物免疫学分析的自动化固相萃取简易方法

本样品制备方法的总体目标是以用户友好、成本低廉且自动化的方式，对水样中的小分子有机污染物进行预浓缩。在采用免疫检测方法（如微孔板免疫分析或生物传感器）研究水样污染时，该方法可替代标准固相萃取（SPE）流程。该技术的主要优势在于固相萃取过程实现了自动化，且与传统方法相比，仪器的体积更小、成本更低。

此外，富集过程的性能在溶剂含量低和预浓缩效率方面均满足免疫分析的要求。首先，使用孔径为0.2微米的滤器过滤100毫米水样。将过滤后的样品置于带有GL 45螺纹的玻璃瓶中。

取一紧盖试管，将甲醇用去离子水稀释至终体积的50%，配制300微升洗脱液。接着，在玻璃小瓶中加入40毫克反相固相萃取吸附剂，先加入1,600微升甲醇，再加入400微升去离子水，配制成20毫克/毫升的十八烷基硅胶固相萃取吸附剂悬浮液。盖紧瓶盖后，用涡旋混合器振荡混匀。

将孔径为11微米的尼龙膜置于双层防尘纸巾上。用直径3毫米的打孔器在膜上切下两个小片。然后用平头滤膜镊子夹取其中一个小膜片，并将其放置于柱子的一侧。

随后，将平底接头与管子拧紧并固定。然后，在柱体上画一个箭头，指向放置膜的一端。此时，将层析柱固定在支架上，使箭头朝向下方。

使用下方的锁扣连接器，将一个空的10毫升一次性注射器连接到柱管末端。用涡旋混合器震荡悬浮液，迅速吸取100微升悬浮液并加至柱子的中央位置。在加样时，用另一只手轻轻用注射器抽吸，使液体缓缓通过膜。

SPE 柱的制备非常重要。在将颗粒悬浮液注入色谱柱时，必须确保使用注射器通过膜充分抽吸溶液，否则颗粒将无法紧密填充。

重复上述步骤两次，在每次移液操作之间振荡储备悬浮液，以确保颗粒在溶液中均匀悬浮。当整个悬浮液通过注射器抽吸完成上样并干燥后，保持注射器位置不变，用另一只手使用镊子将第二张尼龙膜放置在上方。然后，拧紧带有管路的第二个连接头，并弃去注射器。

此时，使用下方的锁紧接头将固相萃取装置上的柱子拧紧。将装有样品的瓶子通过拧上提供的 GL 45 安全盖与装置连接。在洗脱液储液池中加入 200 微升洗脱液。

然后，在稀释储液罐中加入 800 微升去离子水。通过逆时针旋转压力调节器直至无法继续转动，确认其处于关闭位置。启动原型机后，输入 pset 值为 580，delta pset 值为 30。

调节压力调节器时，先启动泵。然后手动旋转压力调节器，直至 preg 的读数低于但接近 320 毫巴。停止泵后，在自动模式角落按下“开始”按钮，启动固相萃取（SPE）程序。

固相萃取（SPE）步骤完成后，盖紧样品小瓶，避光保存于4至5摄氏度，直至进行ELISA分析。为清洗系统，取一GL 45螺口玻璃瓶，配制10毫升体积分数为70%的甲醇溶液。取下固相萃取柱，并使用接头堵住管路。

在自动模式下，选择清洗文件，并使用之前设定的 pset、delta pset 和 preg 压力参数启动运行。通过将移液的吸附剂转移至玻璃小瓶中干燥并称重，评估吸附剂填充的重复性。对 100 毫升样品进行了进样时间重复性的测试。

使用商业化的17β-雌二醇ELISA试剂盒测定初始样品和预浓缩加标样品的浓度。从标准曲线可以明显看出，富集样品中的甲醇比例对免疫测定的灵敏度无影响。去离子水和人工海水中的回收率分别为128 ± 22%和107 ± 6%。

一旦掌握，若操作得当，固相萃取柱的制备可在五分钟内完成。整个固相萃取过程可在一小时之内完成。该技术建立后，为环境科学领域的研究人员探索用于监测小分子有机污染物的免疫检测方法奠定了基础。

观看本视频后，您应能够充分了解如何使用我们这种经济高效、自动化的仪器来制备水样，以便通过免疫分析法检测污染物。请务必注意，操作有机污染物和溶剂时可能存在危险，因此在执行该流程时，应始终采取适当预防措施，例如佩戴合适的手套和防护眼镜。