一种用于从单个样品中全面分析代谢物、脂质和蛋白质的简单分级提取方法

本方法的总体目标是通过简单的分步甲基-叔丁基醚提取，从单个样品中回收并分析所有主要的分子实体，包括极性与中等极性代谢物、脂质以及蛋白质。通常情况下，科学家难以从单一样品中同时分析多种化合物类别。通过本方法所介绍的MTBE提取法，您可从单个样品中提取并分析多种化合物类别，例如脂质、代谢物和蛋白质。

该技术的主要优势在于，能够从小份单一样本中稳定地提取所有类型的分子化合物。该方法有助于回答系统生物学中的基本问题，因为它为多组学分析提供了实验基础，所获得的组分可用于蛋白质组学、脂质组学和代谢组学分析。以下实验方案以拟南芥叶片组织为例进行演示。

拟南芥是十字花科的小型开花植物，与卷心菜有亲缘关系。开始本实验前，先将组织匀浆器的管架置于液氮中预冷至少10分钟。将样品从液氮中取出，放入管架中。

然后将试管架从液氮中取出。迅速将试管架放入组织匀浆机中，并设置匀浆机将生物材料研磨成细小且均匀的粉末。对于叶片，使用20赫兹频率研磨1分钟。

匀浆时间和速度可根据组织类型进行调整。务必充分匀浆，直至样品成为极细的粉末状。在匀浆的每一步骤中，均应保持样品处于冷冻状态。

将样品均质化，然后从试管架上取出生物样品。如果样品不会立即使用，请将其放入-80°C超低温冰箱中，直至进一步提取。用样品编号标记四个2毫升圆底安全锁微离心管。

将离心管和部分刮勺浸入液氮中进行预冷。待离心管和刮勺冷却后，取其中一根离心管置于分析天平上，用刮勺将25毫克组织粉末分装至微量离心管中。记录每个样品的精确重量，然后立即将分装好的样品放入液氮中。

为避免植物材料解冻，请迅速完成此步骤。将分装好的样品在零下80摄氏度条件下保存，直至进行后续提取。为准备提取，将按照随附文件所述配制的甲基叔丁基醚（MTBE）-甲醇提取混合液置于零下20摄氏度冰箱中预冷。

取出分装的样品，向每个样品管中加入一毫升预冷的提取混合液。此步骤需快速操作。MTBE 黏度较低，易从移液枪头滴落。

每份样品加入后应立即在涡旋振荡器上充分混匀，直至组织在提取液中完全匀浆。将离心管置于实验台上的管架中，等待所有样品完成提取。此步骤至关重要。

在此步骤中，我们使蛋白质沉淀并使其酶活性失活。将所有样品置于4°C条件下，在100 RPM的摇床中孵育45分钟。然后将样品置于冰浴超声仪中，超声处理15分钟。

接下来，通过相分离进行分相，向每个样品管中加入650微升水与甲醇按3:1配制的溶液。然后涡旋混匀1分钟。在4摄氏度条件下，以20,000 × g离心5分钟。

此步骤之后，应小心操作离心管，避免两相液体混合或扰动已沉淀的沉淀物。此时，离心管底部有固体沉淀，上方存在两相可分离的液体。上层非极性相含有脂质。

下层水相含有极性和中等极性代谢物。沉淀物中含有蛋白质、淀粉和细胞壁。将上层含脂相中的500微升溶剂转移至已标记的1.5毫升微量离心管中。

然后，使用 200 微升移液器小心移除剩余的脂相并弃去。接着，将下相中的 400 微升溶剂转移至已标记的 1.5 毫升微量离心管中。另取 200 微升等分试样转移至微量离心管，用于进一步分析，例如基于气相色谱的代谢物分析。

用移液器吸除并弃去水相的剩余部分。然后，为洗涤获得的蛋白质-淀粉-细胞壁沉淀，加入500 µL甲醇，再涡旋混匀1分钟。将样品在4 °C条件下以10,000 ×g离心5分钟。

使用氮气流蒸发仪蒸发脂质样品中的溶剂，以避免脂质发生氧化修饰。所得干燥样品应立即进行分析。将水相样品在真空浓缩仪中避热过夜蒸发溶剂。

干燥的水相样品可在负80摄氏度下保存数周后再进行分析。将干燥的脂质组分重新悬浮于400微升体积比为7:3的乙腈与2-丙醇混合溶液中。转移足够量的液体至玻璃小瓶中，并 tightly 密封盖子。

然后，将玻璃小瓶置于4摄氏度的冷却自动进样器中。每份样品进样2微升，使用超高效液相色谱系统在60摄氏度下通过反相C8色谱柱分离脂质，流速为每分钟400微升。色谱分离采用随附文件中表1所述的流动相。

使用合适的质谱仪，在正离子和负离子化模式下采集质荷比范围为150至1500的质量谱图。将极性相重新悬浮于200微升超高效液相色谱级甲醇与水按1:1配制的溶液中。转移足量液体至玻璃小瓶中，并 tightly 封盖。

然后，将玻璃小瓶置于4°C的冷却自动进样器中。从每个样品中进样2 µL，使用超高效液相色谱系统在40°C条件下，通过RP C-18色谱柱进行代谢物分离，流速为400 µL/min。采用随附文件中表2所列参数的流动相进行色谱分离。

使用合适的质谱仪，在正离子和负离子化模式下采集质荷比范围为50至1500的全扫描质谱。最后，按照随附文件所述进行蛋白质提取、消化和分析。采集25毫克拟南芥叶片组织，研磨并提取后，用于三种分析型UPLC-MS平台。

采用反相C-18超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS）对极性和中等极性的初级与次级代谢物进行分析。上图显示的是脂质的基峰色谱图，下图显示的是中等极性代谢物的基峰色谱图，均在正离子化模式下进行分析。每张色谱图右上角的饼状图展示了归属于不同化学类别的已鉴定脂质和代谢物的数量。

例如，有58种不同的脂质被归类至三酰甘油组，在上图中以TAG表示。该组分中极性更强的代谢物，如糖类和极性氨基酸，因在反相材料上保留效果不佳，可采用其他分析方法进行检测，例如气相色谱-质谱联用（GCMS）或亲水相互作用液相色谱。从提取物中获得的蛋白质则在溶液中进行酶解，并采用鸟枪法液相色谱-质谱联用（LCMS）进行分析。

右上角显示的饼状图表示被分配到不同生物学过程的已鉴定蛋白质数量。例如，有268种蛋白质被归类到定位类别中。总之，从本示例所用的此类样本中，通常可鉴定出200多种脂质种类、50种注释的中等极性代谢物以及数千种蛋白质。

此外，该方法在使用不同组织、器官和细胞培养材料时表现出广泛的适用性。观看本视频后，您应能够充分理解如何从单一样品中提取和分析绝大多数必需化合物。在尝试该实验步骤时，重要的是保持所有样品处于冷冻状态，充分研磨材料，并使用分析纯级别的溶剂和化学试剂。

采用此步骤后，可运用所有分析方法来确定提取样品的分子组成。