视网膜疾病评估中的定量眼底自发荧光技术

定量自发荧光（qAF）的总体目标是评估健康眼和患病眼中视网膜支持细胞——即视网膜色素上皮（RPE）——内脂褐素的总体水平。该技术有助于回答视网膜细胞生物学中的关键问题，例如视网膜色素上皮的健康状况如何与年龄相关性黄斑变性（AMD）的发展相互作用。该技术的主要优势在于，它能够测定眼底脂褐素自发荧光的绝对水平，从而实现患者之间、患者不同成像检查之间以及大规模研究人群中的定量且可重复的随访。

成像前，根据制造商的说明，正确设置共聚焦扫描激光检眼镜（CSLO）以进行数据采集。安装内部荧光参考物时（该参考物需从制造商处购买），旋转镜头将其取下，拧下设备的金属环，并更换为含有参考物的新金属环。为确保光线无阻碍通过，瞳孔必须散大至至少6 mm。

使用0.5%托吡卡胺和2.5%去氧肾上腺素，将患者的瞳孔散大至至少6 mm，这是确保光线无阻碍地进入以观察和测量眼底所必需的。将患者正确地安置在共焦扫描激光检眼镜（CSLO）上，下颌置于下颌托上，前额紧贴额部支撑架，并使外眦与定位指示器对齐。为获取基线图像，首先使用近红外反射光（即红外光）对眼底成像，以将相机中心对准黄斑区并获得初步聚焦。

在患者体位正确摆放后，将控制面板上的硬件设置切换至红外成像模式，手动调整相机位置直至眼底完全对焦，然后采集图像。将控制面板上的设置调整为IROCT模式，该模式结合光谱域光学相干断层扫描（SDOCT）与红外成像，用于评估黄斑区潜在的病变。利用成像窗口中提供的参考指南，正确对齐OCT图像与眼底的红外图像。

为了获得最佳的 SDOCT 图像质量，应调整相机位置，使 OCT 图像位于成像窗口的上三分之一区域。至少获取一条通过中心凹的水平线扫描图像，并覆盖整个成像视野。进行 qAF 成像设置时，应采用高速图像采集模式，以降低因患者移动以及虹膜或眼睑遮挡光线所导致的信号丢失风险。

采用9帧平均模式，该模式会快速连续采集九幅图像帧并进行平均处理，以减少噪声和伪影。选择30 × 30度的视野范围，该数值表示图像采集过程中所捕获的视网膜区域的角度大小。在提醒患者将出现蓝光后，开启自发荧光（AF）模式，并调整相机轴线，使眼底自发荧光图像尽可能充满屏幕，同时尽量减少图像边缘和角落的变暗现象。

如果患者难以耐受明亮的蓝光，可先将相机移至距离眼睛较远的位置开始成像，然后缓慢将相机向患者靠近，直至眼底完全可见。可通过手动或使用检眼镜操纵杆，调整相机对准位置，移动共焦扫描激光检眼镜（CSLO）以重新定位相机，使自发荧光（AF）信号在整个视野范围内达到最高水平，而非仅获得最清晰的图像。在图像采集过程中，若内部参考图像或眼底图像中出现可见的彩色像素，则表明信号过饱和，从而导致信号丢失。

在成像期间，将视网膜完全暴露于AF光下至少20秒，以尽量减少感光视网膜中视紫红质对光的吸收。利用此时间段优化相机的对准、聚焦和灵敏度。每次图像采集前让受试者眨眼，因为新鲜的泪膜可提高信号质量。

采集图像时避免眼睑位于成像平面内，并进行拍摄。每次成像过程中至少获取两张高质量图像用于数据分析，这一点非常重要。使用CSLO软件对九帧图像堆栈进行平均值计算，以提高信噪比，完成图像后处理。

根据文本方案进行图像分析。如图所示，在健康眼中，来自视网膜色素上皮（RPE）的自发荧光（AF）在眼底分布相对均匀。由于黄斑色素对光的遮挡作用，中心黄斑区域的荧光强度降低；而眼底周边及角落区域的强度降低则归因于眼球和相机的光学特性。

血管应呈暗色且清晰对焦。该图展示了来自本图的qAF水平对应的热图表现形式。较冷的色彩对应自发荧光强度较低的区域，而较暖的色彩对应自发荧光强度较高的区域。

最大强度通常出现在第二个同心八分环区域，该区域的平均强度被用于大多数数据分析。此处展示的是年龄相关性黄斑变性（AMD）眼的代表性分析，显示地图样萎缩，即AMD的一种晚期形式。这种形式的AMD会导致视网膜色素上皮（RPE）局部缺失，表现为自发荧光（AF）显著减弱或消失，并引起进行性中心视力丧失。

在实施该操作时，重要的是要仔细选择候选患者，并可重复地获取高质量的图像，以最大程度地提高数据质量。使用该方法可实现对视网膜健康的纵向随访，以确定视网膜变性的进展情况。该技术在建立后，为眼科领域的研究人员跟踪和分析视网膜变性铺平了道路。

观看本视频后，您应能充分了解如何使用定量自发荧光技术来评估患有视网膜变性疾病的患者。感谢观看，祝您的实验顺利成功。