大规模扫描透射电子显微镜（纳米解剖学）对健康与损伤斑马鱼脑组织的成像

本大规模电子显微镜或纳米解剖学实验的总体目标是，从大分子水平到组织水平，系统地定义今日案例中斑马鱼退化脑组织的结构变化。纳米解剖学可帮助解答生命科学中的关键问题，例如在神经退行性疾病和1型糖尿病研究中的相关问题。

纳米切片技术的主要优势在于能够无偏倚地获取从大分子、细胞器、细胞到组织的多层次信息。这使得数据可以进行定量分析，并通过 nanotomy.org 实现开放共享。尽管纳米切片技术已用于研究斑马鱼神经退行性脑组织中免疫稳态和小胶质细胞的特征，但它同样适用于其他疾病模型，包括细胞培养、小鼠乃至人类组织。

通常，刚接触该技术的科研人员会感到困难，因为数据量极为庞大，可能比传统电镜获得的数据多出上千倍。根据文本方案固定斑马鱼幼鱼后，从后脑前方切断幼鱼头部，以促进锇酸渗透。将幼鱼置于含1%四氧化锇、1.5%铁氰化钾的0.1摩尔二甲胂酸钠溶液中，冰上孵育两小时。

然后用双蒸水清洗胚胎，每次5分钟，共清洗三次。在包埋前，需将样品经一系列乙醇进行脱水。根据文本方案，将胚胎在稀释的环氧树脂中4℃孵育过夜后，去除稀释树脂，更换为纯树脂进行包埋。

孵育30分钟，然后第二次更换树脂，再孵育30分钟。第三次更换树脂后，在室温下孵育3小时，随后在58摄氏度下孵育15分钟。

最后，在室温下于低压环境中孵育一小时。接着，在解剖显微镜下，使用针或牙签将样品头部置于市售的硅胶平板包埋模具中进行定向。然后在58摄氏度下聚合环氧树脂过夜。

当样品完全硬化后，使用剃刀刀片修剪掉基座上多余的树脂。为确定合适的定位，使用玻璃刀或超薄切片机上的金刚石组织切片刀切割幼虫的半薄切片，用于亚甲蓝/碱性品红染色。用火焰熔封尖端的玻璃巴斯德吸管挑取半薄切片，并将其转移至显微镜载玻片上。

在加热板上干燥至无水分残留。接着，将样品置于1%的甲苯胺蓝水溶液中，并在加热板上孵育10秒以进行染色。然后，用水冲洗切片后，再用0.5%碱性品红与1%硼砂溶液染色额外10秒。

使用普通光学显微镜在10倍至40倍放大倍数下观察样品。当到达合适的位置或方向时，利用易于识别的解剖结构（包括嗅窝、眼睛或灰质-白质边界）来确定超薄切片过程中的目标脑区，并在样品发生倾斜时调整切片角度。继续使用金刚石刀对环氧树脂包埋块进行切片，以获得70纳米的超薄切片。

将每个切片置于带有条形码的铜网上，铜网为单槽L2型，1字形栅格，以避免栅格条干扰成像。一平方毫米看似微小，但恰好能放入开口中。

通过这种方法，我们可以避免网格条遮挡样品。与传统的电子显微镜相比，样品中引入的每一种人工假象都会被记录下来。根据文本中的方案，使用重金属对样品进行染色，并将其存放在网格盒中。将样品装载至扫描电子显微镜（SEM）时，从转移盒中取出载有切片的网格，放入多网格样品台，然后转移至SEM的样品腔内。

根据文本方案调整探测器后，通过缩小视野使待扫描的整个区域恰好位于图像窗口内，对样品进行预照射。将孔径更改为120微米并使图像离焦后，使用减小扫描区域的选项，使扫描区域尽可能紧凑。接下来，设置帧率，使每帧扫描时间约为一到两秒。

然后至少放大100倍，对一个小区域扫描10秒。如果该区域的亮度仍在变化，则继续预照射。当该区域的亮度与其周围环境相比不再发生变化时，即表明预照射已足够。

聚焦时，选择最亮的区域或特征，并设置扫描速度以确保细节清晰可见。在显微镜软件中，通过仔细观察直方图来调节亮度和对比度，使所有像素保持在动态范围内。对最暗的区域和特征进行同样的操作。

返回明亮区域并再次检查，确保直方图两侧均留有一定空间。在执行步骤四十六至四十八时，必须非常谨慎地调整亮度和对比度，以确保整个区域处于动态范围之内。缩小视图，使待扫描的完整区域适配成像窗口，并启动大范围采集程序。

然后使用向导选项，通过从屏幕中选择一个区域来设置拼图图像。根据所需的细节程度，选择2至5纳米的像素尺寸，并为扫描透射电子显微镜（STEM）设置3微秒的停留时间。按下“优化”以检查显微镜设置，所需时间将显示出来。

然后再次打开外部扫描发生器并按继续。为分析STEM数据，启动一个大尺度电子显微图像查看程序，打开名为mosaic info的文件，该文件将加载拼接的tif文件。选择“自动拼接整个图像”选项，并设置以下参数：重叠模式等于half，拼接阈值等于0.90，噪声抑制等于automatic。

如果无法满足拼接条件，则放大图像并手动将图块放置到相应位置，然后单击“继续导出”。将数据导出为 HTML 文件或单个 tif 文件。请包含最终的像素尺寸和文件名，以便后续进行测量，然后根据正文中的实验方案分析数据。如下图所示，对照组脑切片的纳米解剖成像揭示了前脑前端神经组织典型的超微结构特征，包括嗅觉纤维束、神经元细胞核以及神经元亚区室（如突触）。

此处的亚细胞结构包括不同细胞类型和细胞器中的多种细胞核形态以及不同类型的细胞器，如高尔基体、内质网、线粒体、突触小泡和突触后致密区。出乎意料的是，排列在脑室周围的细胞核比大脑中更偏外侧分布的其他细胞具有更高的电子密度。在小胶质细胞中，细胞核也显示出深染的焦点，可能为异染色质，而这些结构在脑内其他细胞中则不存在。

这幅来自斑马鱼幼鱼冠状切面的大规模电镜图像显示了具有吞噬作用的小胶质细胞。这些细胞中也发现了哺乳动物小胶质细胞的典型特征，包括明显的高尔基体以及大量包含体，例如溶酶体。一旦掌握该技术，样本制备可在一天内完成，而传统的电镜技术至少需要一周时间。

在进行该操作时，显微镜操作人员在获取高质量图像方面起着至关重要的作用。这并非简单的按键操作技术。目前，我们不仅已将纳米切片技术应用于神经退行性变的斑马鱼模型，还将其用于细胞的免疫标记，并用于研究果蝇组织、人类组织等更多样本。

该技术为各个领域的研究人员铺平了道路。他们可以在 nanotomy.org 网站上在线重新访问这些数据集，进而探索从纳米到毫米尺度的假定改变，以及所有被研究的模型。

观看本视频后，您应能充分理解如何将纳米解剖技术（nanotomy）应用于您的研究问题以及您正在研究的细胞或组织系统。请注意，由于涉及有毒试剂和伦理考量，样本制备工作必须由专业人员完成；但任何人都可以在家中尝试访问网站 nanotomy.org。